人血管生成素-1基因的克

发布时间：2020-08-12 23:20

【摘要】： 血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)是一种分泌型糖蛋白，可与酪氨酸激酶样受体Tie2结合，使其磷酸化，在细胞中引发一系列化学反应，从而发挥其细胞因子的功能。它在血管生成、创伤修复、肿瘤发生等很多生理病理过程中，都发挥了重要的作用。人血管生成素-1(hAng-1)全长为498个氨基酸，其氨基端为前体蛋白的信号肽区域；羧基端为纤维蛋白原样结构域，可与Tie2结合，是Ang-1生物学活性的决定部位；位于中部的区域富含卷曲螺旋，Ang-1分子通过这段结构聚合形成多聚体。 本实验首先用逆转录PCR从一名健康人骨髓中扩增出hAng-1基因，并将其克隆到pMD18-T Vector上，经过序列测定证实，我们得到了正确的hAng-1基因。为表达hAng-1，构建了pQE31Ang-1和B7Ang-1两种表达质粒，分别在大肠杆菌M15和CHO细胞中进行原核和真核表达。 在原核表达系统中，hAng-1以包涵体形式表达，用镍柱亲和层析对蛋白进行纯化，透析复性后得到可溶的hAng-1。通过鸡胚绒毛尿囊膜(chorioallantoic membrane，CAM)血管生长实验证实，复性的hAng-1具有刺激血管生长的生物活性，2.5μg hAng-1即能有效刺激CAM血管生长。 大肠杆菌中表达的hAng-1蛋白经纯化后，免疫健康大白兔，获得hAng-1多抗。hAng-1多抗经ELISA检测，滴度可达到1：1×10~6。用获得的hAng-1兔多抗包被酶联板，建立夹心ELISA实验，用来检测CHO细胞中的hAng-1表达量，可筛选出高表达的CHO细胞株。 在真核表达系统中，用氨甲喋呤(MTX)对表达hAng-1的CHO细胞进行加压筛选，用饱和硫酸铵沉淀法对细胞培养液中的hAng-1进行浓缩，得到的蛋白用鸡胚CAM血管生长实验检测生物活性，500ng CHO细胞表达的hAng-1能刺激CAM血管生长，其生物活性强于大肠杆菌表达的hAng-1。 通过hAng-1基因的克隆和在原核、真核细胞中的表达，我们得到了具有刺激CAM血管生长活性的重组hAng-1蛋白，并为进一步的研究工作打下了基础。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R346
【图文】：

1基因序列进行同源性比较。实验结果方法进行扩增，第一轮扩增出1700bp的片段，见图1。回收后，与载体pMD18一T连的鉴定杆菌后，随机挑取蓝白斑筛选质粒进行酶切鉴定，用BaxnHI2700bp、1700bp左右片段，bP

图3pMD18Ang一1质粒酶切鉴定M:DL15000DNA分子量标准一:BamHI酶切pMD18一T载体2:BamHI酶切pMD18Ang一1质粒3:BamHI、sall酶切pMD18Ang一l

6pQE31Ang一1质粒酶切鉴:DL15000DNA分子量标准:BamHI酶切pQE一31载体:BamHI酶切pQE3IAng一1:BamHI、Hindlll酶切pQE3M12345、少﨏了.一6JO了

本文编号：2791164