EDAG相互作用蛋白THAP11 对NF-κB活性的抑制

发布时间：2020-08-13 00:05

【摘要】：EDAG基因是本实验室分离克隆的一种与造血细胞增殖分化密切相关的新基因。EDAG基因是从4月龄人胎肝组织与成年肝组织的差异表达基因EST库中分离到的一种新基因片段，mRNA长约2.2 kb,经筛选人胎肝 cDNA文库获1.9kb片段，命名为红系分化相关基因（erythroid differentiation-associated gene，EDAG）。序列分析推测该基因编码484 个氨基酸组成的蛋白质，且在体外实验得到证实，该蛋白定位于染色体9q22。 前期研究表明，EDAG特异表达于造血组织与胚胎组织，并在白血病细胞中高表达。利用反义核酸技术抑制EDAG表达后，可以抑制白血病细胞的增殖能力以及诱导剂所诱导的分化能力。在细胞因子依赖的细胞株中高表达EDAG 可使细胞对细胞因子的依赖性降低，并表现出较强的抗凋亡能力。分子机制的研究表明，EDAG可以通过某些途径活化转录因子 NF-kappaB，使其入核并激活其下游基因如c-myc，Bcl-2 及Bcl-xL等凋亡相关蛋白的表达。 酵母双杂交体系是一种采用分子遗传学手段、通过鉴定报告基因的转录活性检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法。为深入研究EDAG基因激活NF-κB的机制，本研究以EDAG为诱饵蛋白，用酵母双杂交系统从人骨髓cDNA文库中筛选其相互作用蛋白，希望得到一些参与EDAG调控NF-kappaB通路的相互作用蛋白。 本实验分以下几个方面进行研究： 1．诱饵蛋白pGBKT7-EDAG的构建和鉴定 为了筛选EDAG的相互作用蛋白,本研究用PstⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶对PMD-EDAG和pGBKT7载体进行酶切,将EDAG片段插入到pGBKT7载体中,获得诱饵蛋白pGBKT7-EDAG。 2．人骨髓文库中EDAG相互作用蛋白的筛选 利用酵母双杂交方法以1.0kb的EDAG作为诱饵蛋白，筛选在人骨髓细胞中能与EDAG有相互作用的蛋白，这些与EDAG有结合作用的蛋白可能是EDAG的特异性底物或者是在细胞内调节或介导EDAG功能的一些重要介导分子。通过对人骨髓文库的筛选，一共得到57个阳性克隆。发现几个重要的候选基因，他们编码的蛋白分别是：THAP11、ABP-280、IL8等。其中THAP11重复出现10次，本文对THAP-11的功能进 WP=68 行了重点研究。其他相互作用分子ABP280、IL8的相关研究正在进行中。 3．THAP11对NF-κB的抑制及抑制EDAG对NF-κB的活化 通过GST-pulldown、co-IP（免疫共沉淀）验证EDAG同THAP-11的相互作用后，通过报道基因研究THAP11对EDAG调节NF-κB的影响。实验结果证明THAP11不仅抑制NF-κB的活性，而且抑制EDAG对NF-κB的活化作用，提示THAP11可能是EDAG调控NF-κB的重要参与蛋白。 4．人骨髓文库中THAP11相互作用蛋白的筛选 利用酵母双杂交方法以THAP11为诱饵蛋白，从人骨髓cDNA文库中用酵母双杂交系统筛选到其与G蛋白具有强烈的相互作用。G蛋白，比如Ras，也参与细胞的凋亡调控。 综上所述，本实验的主要结论是：THAP11是EDAG的重要相互作用蛋白，可能对EDAG的分子作用机制有重要的调控作用。THAP11可以抑制NF-κB的活性，而且可以抑制EDAG对NF-κB的活化作用。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R346

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本文编号：2791214