人C5a反义肽的分子设计及其功能研究

发布时间：2020-08-21 05:33

【摘要】： 过敏毒素C5a是补体活化、裂解的产物，具有黏附分子调节及免疫调节作用。同时，作为机体一种重要的前炎症介质，其参与了许多疾病的病理过程，并对这些疾病的发生、发展起重要作用。因此，阻断C5a与C5aR的结合，抑制C5a过敏毒素的生物学效应，将对ALI、ARDS及其它C5a相关疾病的预防和治疗起到积极的推动作用。目前，这方面的研究主要集中在C5a单抗及C5a抗血清。本研究以正、反义肽的选择性相互作用的理论为依据，从反义肽分子设计的角度寻找可中和C5a过敏毒素的拮抗多肽。主要的研究内容包括以下几个方面： (1)采用亲水性方案、可塑性方案及可及性方案，对C5a与C5aR结合的功能结构区域进行分析，结果显示：C5a的功能结构区域主要位于氨基端第1～8位，核心区第28～39位及羧基端第65～70位的氨基酸残基。 (2)根据上述C5a功能结构区域的分析结果，结合Baranyi等关于C5a与C5aR分子间作用最强的反义同源盒区(LR3、LR4)序列，确定C5a分子两个功能结合位点区域在第28～40位和第61～74位，分别命名为正义肽L1和L2；按照反义肽分子设计的模型，设计并合成了对应于上述两条正义肽的共四条反义肽，具体序列如下：正义肽L1：V~(28)NNDETCEQRAAR~(40)。其对应的反义肽为：反义肽R1：QLLLLWTLDARRA 反义肽R2：PCSSQLTGFIIIN 正义肽L2：L~(61)RANISHKDMQLGR~(74)其对应的反义肽为：反义肽R3：PSQLHVFMRDISTE 反义肽R4：EARLQRVFLYVNPS (3)采用生物分子相互作用分析(BIA)技术筛选可与csa发生选择性相互作用的反义多肤，并进一步研究其分子间相互作用的结合动力学。结果显示:在上述4条反义肤中，只有一条反义肤(R4)与csa全长分子及正义肤LZ间存在选择性相互作用，其解离平衡常数值(Ko)分别为6.62K10一6M 和4 .508 x1O6M。 (4)通过体外细胞实验，研究反义肤R4对Csa介导的VEC与P入IN粘附的影响。结果显示:当反义肤R4的浓度为1000 ng/ml时，勃附分子 P一Seleetin的表达同单纯Csa刺激组相比出现显著性差异，P一Seleetin表达的阳性细胞率明显降低;当其浓度达so00ng/ml时，vEc上P一Selectin表达量达最低，其表达量可下降20%左右;若进一步增加R4的浓度， P一Selectin表达量再无明显下降。同时，通过检测VEC上豁附的PM…N中 MPO的活性，间接反映VEC与PNfN间豁附性的强弱，结果表明:当反义肤R4的浓度为1000ng/ml时，VEC上砧附pMN中MpO的活性同单纯 csa刺激组相比出现显著差异(P0.05);当反义肤R4的浓度增加至500。 ng/ml，VEC一L勃附的PM刊数量最少，同单纯Csa刺激组相比相差非常显著(P0.01)，其淤。的活性由1 .16Xlo，uzwell下降至o.71Xlo，u/well，降低达40%左右。 (5)采用夹心ELI SA法，测定和比较正常人及发生AIJI后病人血清中 Csa的含量;通过流式细胞术，检测ALI病人血清作用后VEC表面戮附分子:P选择素(P一Selectin)和细胞间勃附分子(ICAM一l)的表达变化;同时检测了粘附于血管内皮细胞表面的PMN中MPO活性，以间接反映血管内皮细胞表面PMN的勃附和聚集。结果显示:ALI病人血清中Csa含量明显升高，其平均值为47.2ng/Ml，同正常组比较相差非常显著(P0.01);ALI 病人血_清刺激后血管内皮细胞表面P一Selectin的表达迅速增加，20min达到高峰，60min后开始降低;ICAM一1的表达较慢，3h开始升高，12h达到最高值，24h内无明显下降，仍维持在较高水平;血管内皮细胞表面粘附的 PNIN中MPO的活性，3h明显升高，12h后达到最高值。结论:(1)根据对人Csa与CsaR结合的功能结构区域进行分析的结果，结合Csa分子的二级结构分析，认为Csa与CsaR结合的主要功能结合位点应位于梭基端第61一74位和核心区域第28一40位氨基酸残基。(2)采用生物分子相互作用分析(BIA)技术证实:按照反义肚分子设计的MBB模型，设计、合成的Csa反义肤与Csa及其正义肤分子间确实存在选择性相互作用;筛选获得一条可与Csa全长分子及正义肤LZ发生选择性相互作用的反义多肤(R4)，其与Csa分子间相互作用的解离平衡常数值(KD)为6.62X 10一6M，与其正义肤LZ分子间的丸为4.508xlo一6M，符合文献报道的弱亲和力生物分子间相互作用的基本规律。(3)体外细胞实验表明:反义肤 R4可以剂量依赖关系拮抗Csa介导的VEC表面豁附分子P一Selectin的表达，减少VEC上豁附PMN的数量，其拮抗效率在20%到40%之间。另外，估计反义肤R4与Csa分子间的计量配比关系应在2一10之间。其作用的机制为:Csa反义肤选择性结合于Csa，从而有效地阻断Csa与CsaR 的结合，对Csa过敏毒素的生物学活性发挥拮抗作用。(4) ALI后由于Csa 含量的升高，血管内皮细胞表面豁附分子:P一Selectin和ICA人1一1等表达的上调，致使大量PMN在肺微血管内扣押、聚集进而同肺血管内皮细胞发生粘附，促进了ALI及ARDS的发生、发展。尽管八击1的发生是诸多因素在多个环节共同作用的结果，但本研究的结果对于过敏毒素Csa在A工1形成中的始动因素地位机制是一个有力佐证，将有助于对ALI发病机理的阐明，同时也为以补体Csa为靶向，
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R392

【参考文献】