兔成骨细胞的培养及生长因子对其体外增殖影响的实验研究

发布时间：2020-08-20 18:28

【摘要】： 目的：大型颌骨缺损历来是临床修复的难点，尽管可供选择的治 疗手段很多，但很少有一种方法能比较理想地解决修复问题，获得令人满 意的效果。骨组织工程的提出为解决这一难题提供了新的途径。成骨细胞 作为骨组织工程的种子细胞，它的获取和培养是组织工程中最基础和最为 重要的环节。在成骨细胞多种来源中，骨髓来源最为优越。骨髓来源的成 骨细胞由骨髓内骨祖细胞分化而来，但骨祖细胞数量有限，增殖较慢，难 以适应种子细胞库大量细胞的需要。本实验采用兔骨髓基质细胞作为骨组 织工程种子细胞的来源筛选培养兔成骨细胞，并观察其生物学特性，为从 骨髓途径获取筛选种子细胞并应用于骨组织工程修复颌骨缺损提供一定的 实验依据；并探讨胰岛素样生长因子Ⅱ（insulin-like growth factor Ⅱ，IGF Ⅱ）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，b-FGF）、转化 生长因子-β（transforming growth factor β，TGF-β）这3种生长因子单独及交互 联合应用后对成骨细胞增殖的影响，希望能选择一种合适的促进成骨细胞 增殖的方法，为成骨细胞适应骨组织工程种子细胞库的大量需要提供一定 的实验基础。 方法：抽取日本大耳白兔骨髓液经离心后得骨髓单个核细胞，经 兔成骨细胞的培养及生长因子对其体外增殖影响的实验研究 PBS液洗涤后以 IX 10fynd的细胞浓度进行培养，2周后得到贴壁生长的单 层细胞。随后进入传代培养，通过倒置显微镜、HE染色、扫描电镜、透 射电镜、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色、I型胶原免疫组化染 色、钙染色等手段对获得的细胞进行生物学特性研究。然后将细胞与载体 材料聚乳酸（PLA）、膨体聚四氟乙烯（OPTFO复合培养1周后回植自体兔肌 肉内，4周、巴周后植人部位取材，组织学方法观察其体内成骨能力。并采 用体外培养的第5代成骨细胞，用鹰陛蓝比色法，观察胰岛素样生长因子 11、碱性成纤维细胞生长因于、转化生长因子·p这三种生长因于单独及交 互联合应用后对成骨细胞体外增殖的影响。 结果：在形态学上，本实验所培养的细胞能够贴壁，呈多种形态， 有粗细不均的胞浆突起，并且呈集落样生长，可相互重叠成复层生长，并 形成细胞结节。电镜下可见典型的蛋白质合成结构；胞浆富含线粒体、粗 面内质网和高尔基体，表明合成分泌功能旺盛，符合成骨细胞的形态及生 长特性。在生化和”组织化学上，培养细胞富含ALP活性，主要合成1型胶 原，并且在条件培养基中可以钙化（Von Kossa染色阳性）。符合成骨细胞 鉴定的标准。且细胞经连续传代，形态与功能不变。成骨细胞经体外增殖， 与载体复合培养后生长良好。植入体内后早期（4周时）形成的骨基质结 构疏松，。周围仍有较多成骨细胞，晚期（8周时）则可见形成的骨样组织 结构致密，内有骨细胞位于骨陷窝中，与典型的骨组织结构基本相似。 在相同培养条件下，三种生长因子均能促进成骨细胞增殖，IGF．H、 bFGF这两种生长因于在0．l－10．ong／thl浓度范围内与兔成骨细胞增殖呈剂 量·效应关系，并以10．onglml这个浓度促增殖作用最为显著，浓度超过该 值后，促增殖作用反而下降。TGF－D在0。olghl时促增殖作用最为显著， 随着浓度增高，作用下降。选择较佳效应浓度的3种生长因于与兔成骨细 胞培养 1天后，除 10．0 il bFGF外，其余促增殖作用均不显著，3天后 第2页 兔成骨细胞的用养及生长因于对其体外增殖影响的实验研究 出现促增殖差异，5天后，生长因子促进兔成骨细胞增殖作用达到最大，7 天后，作用减弱。三种生长因子交互作用时，对兔成骨细胞的增殖有协同 作用，均促进兔成骨细胞的增殖，并以生长因于 bFGF＋GF·11与 bFGF＋IGF·H可GF小联合作用效果较为显若。 结论： 二．兔骨髓基质细胞经体外培养后生长活跃，具有与成骨细胞相似的形态 特征及生长特点；具有较强的ALP活性，能分泌I型胶原，能体外钙化； 细胞一载体复合物植入体内八周后能形成骨组织。表明：我们从兔骨髓中 筛选培养成功的细胞是兔成骨细胞，从骨髓中获取成骨细胞的方法是可行 的。 2．三种生长因于均能促进兔骨髓成骨细胞的增殖，生长因子促增殖作用 有剂量依赖性和时间依赖性，三种生长因子交互作用时有协同作用，提示 生长因子在体外可促进兔成骨细胞增殖，可作为在较短时间快速获得骨组 织工程种子细胞一成骨细胞的一种有效的途径。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2001
【分类号】：R329.2

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