IP10，ITAC及其双功能分子诱导的抗肿瘤免疫及机制研究

发布时间：2020-08-29 12:25

　　肿瘤是严重威胁人类健康的一类疾病，随着生物技术的发展，基因治疗有望成为攻克肿瘤的突破口。在肿瘤患者重建有效的免疫应答及抑制肿瘤血管生成，是肿瘤治疗的重要策略。研究表明，趋化因子不仅具有引导淋巴细胞定向迁移的功能，并能作为免疫调节因子，参与淋巴细胞的活化过程。趋化因子还能调节血管生成。在动物实验中，趋化因子用于肿瘤治疗已经取得了显著成效。4T1是BALB／c鼠源性乳腺癌细胞系，RT-PCR结果显示，具有募集效应细胞及抑制血管生成作用的趋化因子IP10及ITAC在4T1细胞的表达水平较低。我们推测增强IP10或ITAC在4T1细胞的表达可能会影响4T1肿瘤的发生和发展。本研究以小鼠4T1乳腺癌为模型，观察改变IP10或ITAC的表达对4T1肿瘤生长的影响及其机制。最后，根据趋化因子功能特点，将趋化因子作用显著的结构域组合起来，构建了功能更显著的抗肿瘤分子，可能为趋化因子用于肿瘤的生物学防治提供理论基础和实验依据。 1．IP10的抗肿瘤作用及其机制我们构建了pcDNA3-IP10真核表达质粒。电穿孔的方法将质粒导入4T1细胞，获得稳定转染细胞株4T1-IP10。雌性BALB／c小鼠及裸鼠皮下接种4T1-IP10细胞后形成的肿瘤较对照组生长缓慢，肿瘤较小，重量较轻(P＜0.05)，并且4T1-IP10荷瘤小鼠存活时间明显延长。实时定量PCR结果表明，在4T1-IP10肿瘤组织中IP10表达水平显著上调。我们观察了IP10对淋巴细胞在肿瘤局部浸润的影响，结果表明，单位重量的4T1-IP10肿瘤浸润淋巴细胞数量是对照组的两倍；免疫荧光染色发现，T淋巴细胞在4T1-IP10肿瘤内浸润显著增加；FACS分析肿瘤浸润淋巴细胞的表型，结果显示，4T1-IP10肿瘤内CXCR3~+CD4~+T和CXCR3~+CD8~+T细胞比例均较对照组增高。将4T1-IP10肿瘤浸润淋巴细胞分离出来，体外经特异性刺激后，增殖应答能力和特异性杀伤活性增强，肿瘤浸润淋巴细胞IFN-γ分泌明显增加。以上结果提示，募集并增强肿瘤浸润淋巴细胞的效应功能在IP10介导的肿瘤生长抑制中具有重要的作用。我们进一步观察了肿瘤局部IP10表达对机体细胞免疫应答的影响。体外特异性刺激后，4T1-IP10荷瘤小鼠的脾细胞抗原特异性增殖应答能力及杀伤活性均较对照组显著增高(P＜0.05)。肿瘤转移是肿瘤患者常见的死亡原因，诱导有效的细胞免疫应答是抑制肿瘤转移的策略之一。实验性肺转移研究发现，与对照比较，接种4T1-IP10的小鼠，经尾静脉注射4T1细胞后，大体标本观察发现，肺表面形成的转移结节显著减少。4T1-IP10组小鼠肺重明显减轻，肺组织内转移的细胞形成的克隆显著减少(P＜0.05)。肺组织形态学观察发现，4T1-IP10组肺组织内仅有小的单一转移病灶，而对照组转移灶较大并且可以形成多发的转移病灶。以往研究表明IP10具有抗血管生成的作用，因此，我们观察了IP10抗血管效应在IP10介导的4T1肿瘤生长抑制中的作用。实验结果表明，随IP10浓度的增加，内皮细胞增殖显著受到抑制。划痕实验表明，IP10能抑制bFGF诱导的血管内皮细胞迁移的80％。小鼠cornea micro-porket模型研究表明，IP10能显著抑制bFGF诱导的血管生成。将血管内皮细胞在4T1-IP10肿瘤细胞的条件培养基中培养7天，结果显示，4T1-IP10肿瘤细胞的条件培养基能显著延长血管内皮细胞的生长周期，抑制血管内皮细胞增殖。肿瘤组织HE染色，光学显微镜下观察，在4T1-IP10肿瘤局部可以看到血管闭塞现象及肿瘤局灶性坏死，而对照组血管密度高，并可以看到大的血管腔，提示IP10能通过抑制血管内皮细胞生长，抗肿瘤血管生成，使肿瘤局部缺血坏死，发挥抗肿瘤作用。 2．ITAC的抗肿瘤作用及其机制我们通过基因转染的方法建立了稳定转染pcDNA3-ITAC的4T1细胞(4T1-ITAC)。将4T1-ITAC细胞在小鼠皮下接种，观察肿瘤生长状况。结果显示，在BALB／c小鼠及裸鼠体内4T1-ITAC肿瘤生长较对照组缓慢，肿瘤较小并且重量较轻(P＜0.05)，荷瘤小鼠存活时间明显延长。但是在裸鼠体内4T1-ITAC生长抑制作用没有在BALB／c小鼠体内明显。提示T细胞可能参与了ITAC介导的肿瘤生长抑制。实时定量PCR结果表明，在4T1-ITAC肿瘤组织中ITAC表达水平显著上调。为分析ITAC在肿瘤局部表达对肿瘤淋巴细胞浸润的影响，我们分离并计数了肿瘤浸润淋巴细胞，结果显示，单位重量的4T1-ITAC肿瘤内分离的淋巴细胞数量显著增加，是对照组的3倍。鉴于ITAC是CXCR3的配体，我们分析了CXCR3~+淋巴细胞在肿瘤内的浸润情况。FACS分析表明，CXCR3~+淋巴细胞比例在4T1-ITAC肿瘤显著增高，并且在4T1-ITAC肿瘤内CXCR3~+CD4~+T和CXCR3~+CD8~+T淋巴细胞比例均高于对照组。对于ITAC是否影响被趋化的淋巴细胞的效应功能尚未报道，因此，我们分析了在肿瘤局部表达的ITAC对肿瘤浸润淋巴细胞的效应功能的影响。结果发现4T1-ITAC肿瘤浸润淋巴细胞，体外经4T1特异性刺激后显著增殖，杀伤活性较对照组明显增强。ELISPOT检测发现，4T1-ITAC肿瘤浸润淋巴细胞IFN-γ分泌增加(P＜0.05)。这些结果表明ITAC能促进肿瘤淋巴细胞浸润，并增强肿瘤浸润淋巴细胞的效应功能，可能是ITAC介导肿瘤生长抑制的机制之一。为进一步确证ITAC的抗肿瘤效应，我们检测了荷瘤小鼠的细胞免疫应答水平。结果显示，4T1-ITAC荷瘤小鼠的脾细胞特异性增殖反应明显增强，对4T1细胞的特异性杀伤活性增高(P＜0.05)。我们利用实验性肺转移模型检测了4T1-ITAC荷瘤小鼠对4T1细胞在体内播散转移的影响。结果表明，接种4T1-ITAC肿瘤细胞的小鼠，其肺表面没有明显的转移结节形成，肺重明显减轻。肺组织转移细胞克隆形成显著减少(P＜0.05)。肺组织HE染色观察发现，4T1-ITAC组未见明显的转移病灶形成。这些结果提示ITAC在肿瘤局部表达能保护小鼠，降低肿瘤播散转移的发生率。此外，我们检测了ITAC的抗血管生成作用。划痕实验表明ITAC能抑制bFGF诱导的血管内皮细胞迁移的55％。MTT法检测，随ITAC浓度的增加，对血管内皮细胞增殖的抑制效果不明显。与4T1细胞培养上清比较，4T1-ITAC细胞的条件培养基能抑制血管内皮细胞增殖，但是与RPMI1640组比较没有显著差异。以上结果可能提示，ITAC具有一定的抗血管作用，并且参与了ITAC介导的肿瘤生长抑制，但不是主要的机制。 3．双功能分子的设计及构建我们将先前的结果进行了统计学分析。与IP10比较，ITAC具有较强的趋化作用及诱导抗肿瘤细胞免疫应答的作用。与ITAC比较，IP10抑制血管内皮细胞增殖的作用更显著。结构功能分析表明，趋化因子的N端和N-LOOP区是结合及活化受体的关键部位，而趋化因子的C端可以结合在血管内皮细胞表面，发挥抗血管生成的作用。结合以往文献资料，我们设想ITAC的N端和N-LOOP区与IP10的C端融合，构建一个新型融合分子，具有ITAC和IP10分子的各自优点，有望产生更显著的抗肿瘤治疗效果。我们首先对双功能分子进行计算机模拟。将ITAC的N端和N-LOOP区与IP10的C端氨基酸序列输入InsightⅡ工作站，模拟结果表明，两个功能结构域组合后能形成趋化因子样稳定的空间构象，与IP10的氨基酸同源性达到66％，与已有的IP10的晶体衍射结构相似，RMS值为1.08。我们将该分子命名为双功能分—ITIP。我们通过PCR的方法扩增得到双功能分子ITIP的全长编码基因，构建pcDNA3-ITIP质粒，电穿孔法将质粒转染4T1细胞并筛选稳定转染细胞株4T1-ITIP。RT-PCR结果表明仅在4T1-ITIP细胞中有ITIP的转录。趋化实验表明，4T1-ITIP细胞上清对淋巴细胞具有显著趋化活性，并能被CXCR3抗体特异性阻断，并且ITIP趋化活性与ITAC没有差异，但是较IP10增强。这些结果提示4T1-ITIP细胞能分泌具有活性的ITIP蛋白。 4．双功能分子的抗肿瘤作用及其机制我们以4T1乳腺癌为模型研究了ITIP的抗肿瘤作用。BALB／c小鼠皮下接种5×10~4 4T1-ITIP肿瘤细胞后，成瘤率为3／10，而4T1-IP10及4T1-ITAC的成瘤率分别为7／10和6／10，对照组小鼠全部有肿瘤生成。将1×10~5 4T1-ITIP细胞皮下接种裸鼠，结果4T1-ITIP肿瘤与4T1-IP10肿瘤生长较其余各组显著减慢。可能提示ITIP具有抑制血管生成的作用，并且参与了ITIP的抗肿瘤效应。但是在裸鼠体内4T1-ITIP肿瘤抑制作用没有在BALB／c小鼠体内明显，提示T细胞可能也参与了ITIP介导的肿瘤生长抑制。我们分析了ITIP在肿瘤局部表达对淋巴细胞浸润的影响。FACS分析肿瘤浸润淋巴细胞，结果显示，CXCR3~+淋巴细胞在4T1-ITIP肿瘤内显著增加，并且CXCR3~+CD4~+和CXCR3~+CD8~+T淋巴细胞比例均高于对照组。我们进一步检测了ITIP对肿瘤浸润淋巴细胞的效应功能的影响。在荷瘤小鼠体内被动转移CFSE标记的淋巴细胞后，在4T1-ITIP肿瘤内CFSE标记的淋巴细胞出现明显的扩增。将肿瘤浸润淋巴细胞在体外特异性刺激，4T1-ITIP肿瘤浸润淋巴细胞特异性增殖应答能力及杀伤活性显著增强，IFN-γ分泌明显增加(P＜0.05)。我们还分析了4T1-ITIP荷瘤小鼠细胞免疫应答水平。4T1-ITIP荷瘤小鼠脾细胞在体外以4T1特异性刺激后，脾细胞特异性增殖反应显著增强，对4T1靶细胞的杀伤活性明显增高(P＜0.05)。ELISA检测细胞因子分泌水平，结果表明，4T1-ITIP组小鼠脾细胞IFN-γ和TNF-α分泌显著增加而IL-4分泌水平显著降低。提示ITIP表达能增强机体细胞免疫应答水平，并向Th1型免疫应答偏移。为观察ITIP对血管内皮细胞生长的影响，我们收集了4T1-ITIP细胞的培养上清，检测4T1-ITIP细胞的培养基中血管内皮细胞生长动力学变化。结果显示，在4T1-ITIP肿瘤细胞的条件培养基中，血管内皮细胞的生长显著受到抑制，提示4T1-ITIP能分泌具有抑制血管内皮细胞生长活性的ITIP，发挥抗血管生成效应。综上所述，抑制肿瘤血管生成并诱导有效的抗肿瘤免疫应答，是IP10及ITAC抗肿瘤的重要机制。增强IP10(ITAC)分子与其受体CXCR3的相互作用将有利于肿瘤的治疗。更重要的是，通过以上研究，我们发现ITAC具有更显著的趋化淋巴细胞及诱导特异性免疫应答的作用，而IP10具有更明显的抗血管生成的作用。我们将ITAC分子的N端和N-LOOP区及IP10的C端结构域组合，构建的双功能分子ITIP产生了更有效的抗肿瘤作用。本研究为临床制定抗肿瘤生物治疗策略提供了实验基础，并为应用趋化因子进行肿瘤治疗研究提供了新的思路。
【学位单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2005
【中图分类】：R392
【部分图文】：

含氨,质粒DNA,抽提,液体

ITAC及双功能分子诱导的抗肿瘤免疫及机制研究第一部分醇，一20℃放置30分钟，10000rpm离心10分钟，弃上清，将沉淀用70%洗一次，即得到纯化的PCR产物。将纯化的PcR产物6ul与pUCm一T载体用T4DNA连接酶连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DHS。，a一互补法筛选菌落，经PCR及酶切鉴定IP10及工TAC插入pUClll--T后，以载体通用测序引上游引物分别与IP10及ITAC的上游及下游引物PCR鉴定插入片段的方向小。然后扩增阳性菌落，小量培养后提取重组质粒工TAC一pUCmT和一pUCmT。再分别用EeoRV、BalnHI和EeoRI、Xhol双酶切ITAC一pUCmT载体IO一pUCmT载体，将酶切片段用低熔点胶回收并纯化。将酶切片断与经相应的pcDNA3连接，将连接产物转化大肠杆菌DHSQ，氨节青霉素筛选抗性菌经PcR、酶切及测序鉴定证实成功构建了pcDNA3一IP10和pcDNA3一ITAC真达质粒。

趋化因子,细胞系,效应细胞

ITAC及双功能分子诱导的抗肿瘤免疫及机制研究第一部分结果1.趋化因子在4ri细胞系表达变化RT一PCR方法扩增16种趋化因子的基因编码片段(图1)，具有趋化效应细胞功能的MIP一2、MIP一la、BRAK、SDF一1及抑制血管生成的PF4、BCA一1及既具有抗血管生成作用又能趋化效应细胞的工P10和ITAC表达量较低。

测序,真核表达质粒,工人,重组质粒

LARC;lane16， BRAK;lane17，SDF一1.2.pcDNA3一IP10真核表达质粒的构建及鉴定将RT一PCR法扩增到的34Obp的IP10基因编码片段与peDNA3重组，如图2所示，重组质粒peDNA3一IP10经pCR、反口尸了和肋01酶切及测序证明真核表达载体构建成功。340bPCCCATGGGCGGCCG以汀GCAG人C(认GGTCTATAAGAATCCGGCCGCCAGGCATCCACTGTAACCACAGAAGGTAGCGTGGAG1，GTGCACGTGAC了叮人G人CAO幻妙汀人「l一fffC六TAGCCAAGTAG人ACAG窄叮AGATGT肖CGGACCTTCrAGAAAG口rTCTGCAGCCTGGTAATACGTGGCTGCATG丁C以AGACAGCAGAGGGTCAGJ门，CC丁GGC六CAGA口TCI，1.ATTGGAGGCTCA以CTCAGACGTTCCCAGGATGTCACATUI一l一王一fGACGC已汀人A儿认TT公1一l丁I一曰一工一CTATI，GCCrGCA们认TGAGGCGAGCI’ FGCrTGG人C了GGGGI.CC六GGCAC公I’l一r引，C万1’1一工人TGAGCCTT口、TAGT人AC人ATAC门，C共ACI一厂fGI

【共引文献】