胍基丁胺对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响及机制的初步研究

发布时间：2020-09-12 12:10

　　缺氧性肺动脉高压是高原肺水肿、高原心脏病和慢性肺源性心脏病等疾病发生发展的中心环节。大量研究显示,缺氧引起的肺血管收缩,尤其是肺小动脉平滑肌收缩和结构改建是缺氧性肺动脉高压形成和维持的基础。在体实验证明,缺氧可引起多种细胞因子含量的改变,如血小板源性生长因子、内皮素等,同时也能引起钾离子通道活性的改变及缺氧诱导因子等基因的的转录激活。缺氧虽不能增加肺组织中血管紧张素-II的含量,但却能增强血管紧张素-II的受体(AT1)的表达。体外培养实验显示,缺氧培养可刺激肺动脉平滑肌细胞增殖,表明肺动脉平滑肌细胞可直接感受缺氧的刺激信号。在上述多种机制的共同作用下,肺动脉平滑肌细胞增殖加强,无肌性微血管发生肌化,细胞外基质大量生成,进而肺血管发生结构重建,管壁增厚,管腔狭窄,阻力增大,最终导致肺动脉高压的发展和维持。胍基丁胺(AGM)是L-精氨酸在精氨酸脱羧酶(ADC)作用下的产物,几乎在哺乳动物体内所有器官和组织内都有分布,其含量呈器官特异性。已有研究显示,胍基丁胺在心血管系统有着广泛的生理作用。胍基丁胺能降低心率、平均动脉压、左室压、外周血管阻力和心指数等,提示胍基丁胺是一种新的血管活性物质。本实验室的研究显示:肺组织中有胍基丁胺,主要分布在血管平滑肌和支气管平滑肌中。胍基丁胺可引起离体肺动脉剂量依赖性舒张。上述结果提示胍基丁胺在肺循环的调节中具有重要作用,但迄今为止,有关胍基丁胺对肺血管平滑肌细胞增殖的调控作用尚未见报道。本实验通过组织块贴壁法原代培养大鼠肺动脉平滑肌细胞,在肺动脉平滑肌细胞常氧血清培养和缺氧培养过程中应用胍基丁胺处理,观察肺动脉平滑肌细胞3H-胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)的掺入、细胞周期中各期细胞百分比与增殖细胞核抗原表达的改变,探讨胍基丁胺对肺动脉平滑肌细胞增殖的影响。同时观察胍基丁胺对血管紧张素-II和血小板源性生长因子所刺激的肺动脉平滑肌细胞增殖的影响,以及胍基丁胺对两种因素刺激作用下细胞增殖中细胞内丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)含量的影响,探讨胍基丁胺调节肺动脉平滑肌细胞增殖的可能机制,为深入揭示肺动脉高压的形成 WP=9 和发展提供理论依据,同时也为胍基丁胺在防治缺氧性肺动脉高压中的应用提供实验依据。本实验共分三部分。第一部分为大鼠肺动脉平滑肌细胞的原代培养、免疫组化鉴定和生长曲线测定。原代培养雄性Wistar大鼠肺动脉平滑肌细胞,传代纯化,用抗(-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体作免疫组化鉴定,细胞纯度在98%以上。在培养过程中应用大剂量胍基丁胺(1mmol/L)处理,测定细胞培养液中乳酸脱氢酶的含量,同时观察细胞形态学的改变。观察胍基丁胺(100(mol/L)对肺动脉平滑肌细胞生长曲线的影响。第二部分为胍基丁胺对大鼠肺动脉平滑肌细胞增于的影响。取培养至5-10代的肺动脉平滑肌细胞,按实验设计进行分组。实验分为常氧培养部分和缺氧培养部分,用缺氧孵箱进行缺氧培养,氧浓度定为2.5%。实验测定指标有3H-TdR掺入量、细胞周期和增殖细胞核抗原含量。3H-TdR掺入量测定时,常氧部分实验分组为无血清组(SF)、10%新生小牛血清组(S)、血清复合胍基丁胺组(SA)。其中血清复合胍基丁胺组再分为:单纯血清培养组、50(M AGM组、100(M AGM组、200(M AGM组和500(M AGM等组。缺氧部分分组为单纯缺氧组、50(M AGM组、100(M AGM组、200(M AGM组和500(M AGM组。用液闪计数法测量肺动脉平滑肌细胞3H-TdR的掺入量。细胞周期测定时,常氧部分实验分组为单纯血清培养组和血清复合胍基丁胺(100(M AGM)组,缺氧部分实验分组为单纯缺氧组和缺氧复合胍基丁胺(100(M AGM)组,用流式细胞仪测定细胞周期中各期细胞所占比例。增殖细胞核抗原含量测定时,常氧部分实验分组为单纯血清培养组和血清复合胍基丁胺(100(M AGM)组,缺氧部分实验分组为单纯缺氧组和缺氧复合胍基丁胺(100(M AGM)组,用免疫组化法作增殖细胞核抗原染色,图像分析法测定其相对含量。第三部分为胍基丁胺调控大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖机制的初步研究。实验测定指标有3H-TdR掺入量和丝裂原活化蛋白激酶含量。实验分常氧部分和缺氧部分。常氧部分分组为Ang-II组、Ang-II复合胍基丁胺组、PDGF组和PDGF复合胍基丁胺组。用液闪计数法测量肺动脉平滑肌细胞3H-TdR的掺入量,用免疫组化作MAPK染色,用图像分析法测定其相对含量。缺氧部分分组为Ang-II组、Ang-II复合胍基丁胺组、PDGF组和PDGF复合胍基丁胺组。用液闪计数法测量肺动脉平滑肌细胞3H-TdR的掺入量。主要结果 1.大剂量胍基丁胺对肺动脉平滑肌细胞形态无显著影响,细胞培养液中乳酸脱氢酶浓度与对照组相比无显著差异。 2.胍基丁胺影响肺动脉平滑肌细胞的生长曲线,细胞增殖显著减慢。 WP=10 3.胍基丁胺对常氧无血清培养的肺动脉平滑肌细胞增殖无显著影响;胍基丁胺对10%NCS刺激的肺动脉平滑肌细胞的增殖有显著抑制作用,且呈剂量依赖性。 4.胍基丁胺对缺氧无血清培养的肺动脉平滑肌细胞增殖有显著抑制作用,且呈剂量依赖性。 5.胍基丁胺使血清和缺氧诱导增殖的肺动脉平滑肌细胞的细胞周期各期比例发生改变,G0/G1期细胞比例增加,而G2/M期细胞比例减少。 6.胍基丁胺能使血清和缺氧诱导增殖的肺动脉平滑肌
【学位单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R363

【参考文献】