构建调控分泌成熟胰岛素的逆转录病毒重组质粒

发布时间：2020-09-16 14:01

　　前言以DNA重组技术为核心发展起来的分子生物学技术，是人们认识生命本质的有利工具，已经渗透到工、农、医等各行业为各行业的发展做出无法估量的贡献。基因治疗已成为医学各学科研究疾病治疗的新途径和热点。1型糖尿病以单一一种蛋白质--胰岛素缺乏为特点，无疑成为基因治疗的理想疾病。糖尿病的基因治疗国内外很多实验已经在糖尿病动物模型内尝试，基因治疗目前急待解决的问题是胰岛素的合理调控分泌和安全有效的载体导入系统。本实验在前人的基础上，在突变的胰岛素原基因的上游连接二个调控元件：肝丙酮酸羧激酶(L-PK)基因启动子中的葡萄糖反应元件(GLRE)和胰岛素生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)基因启动子胰岛素反应序列，并转导入逆转录病毒载体。预想籍此转入鼠肝细胞完成胰岛素受血糖刺激和自身反馈抑制的理想分泌，从而为糖尿病基因治疗的进展并最终应用与临床做基础性的铺垫。实验材料与方法 1．Mini Best plasmid Purification Kit提取质粒pLXSN-INS，pMD18-T-INS并鉴定。 2．测序鉴定pUC-GI质粒。 3．对突变的胰岛素原基因、胰岛素生长因子结合蛋白-1基因(IGFBP-1)、丙酮酸羧激酶基因(L-PK)进行限制性酶图谱分析。选择合适的限制性内切酶位点进行基因重组。 4．重组突变人胰岛素原基因：在其上游重组调控分泌元件 (1)．XbaⅠ限制性内切酶切pMD18-T-INS质粒，3’平滑，5’磷酸化；SalⅠ再次酶切，电泳切胶回收418bp条带。 (2)．SphⅠ限制性内切酶切pUC-GI质粒3’平滑，5’磷酸化；SalⅠ再次酶切，电泳切胶回收3740bp条带。 (3).连接上述两步骤产物。 (4).连接产物全量转人感受态细胞，筛选阳性克隆，提取纯化。 (5).鉴定重组质粒pUC一Gn。 5.构建含调控元件的突变人胰岛素原基因的逆转录病毒重组质粒。 (1).限制性内切酶Hindln酶切pUC一Gll质粒，产物乙醇精制后3’平滑，5’磷酸化;限制性内切酶Ec0RI再次酶切，电泳切胶回收1008坤条带。 (2).限制性内切酶BalnHI酶切pLXSN一INS质粒，产物乙醇精制后3’ 平滑，5’磷酸化;Ec0RI再次酶切，酶切产物全部上样电泳胶回收59加坤条带。 (3).连接上述两步骤产物. (4).转化感受态细胞JM 109，涂板过夜培养，筛选阳性克隆并提取纯化。 (5).PCR及酶切方法鉴定重组质粒pl盆SN一Gll。实验结果 1.突变的胰岛素原基因、胰岛素生长因子结合蛋白一1基因(IGFBP- 1)、丙酮酸梭激酶基因(L一PK)进行限制性酶图谱分析结果见图9。 2.限制性内切酶Xbal，sall分别对应在T载体的T一A克隆位点 EeoRV两侧，两酶切pMD18一T一INS后，切下约2690bp的载体片段及约 418bp左右的突变胰岛素原基因片段。切胶回收突变胰岛素原基因片段电泳结果见图1。 3.限制性内切酶印hI，S欲I双酶切pUC一GI质粒后，胶回收3740bP条带电泳结果见图2。 4.分别应用限制性酶切及PCR两种方法鉴定重组质粒pUC一Gll。电泳结果分别见图3，图4。 5.重组质粒pUC一Gll插人片段的上游多克隆位点含有Ec0IU限制性酶切位点，下游含有Hindln酶切位点。双酶切后回收loosbP的目的DNA 片段，电泳结果见图5。 6.pLXSN一INS质粒的突变胰岛素原基因插入在载体的多克隆位点的 Ec0RI及BamHI两限制性酶切位点之间。BamHFEco班双酶切下的载体片段电泳结果见图6。 7.选择合适的限制性内切酶鉴定重组质粒pLXSN一Gll，结果见图7。应用多聚酶链式反应进一步鉴定重组质粒结果见图8。讨论近年来，利用基因工程建立和分泌胰岛素的细胞系治疗糖尿病已经引起科研工作者的极大兴趣，并取得了可喜的进步。但糖尿病的基因治疗又面临着巨大的挑战，其中之一就是采取何种策略将胰岛素的水平限制在一个非常狭窄的生理范围内，否则，若将基因工程改造后的p细胞应用于人体内，会因为细胞释放过多的胰岛素引起低血糖，甚至严重致死。一些来源于真核细胞的启动子曾经尝试调控基因的表达，启动转录的物质为类固醇激素、氧气、重金属、或物理刺激(如放射线等)。然而这些启动子并不适用于应用临床治疗。本实验选取胰岛素生长因子结合蛋白一1基因调节区及丙酮酸梭激酶基因的葡萄糖反应元件区作为基因调节序列，突变人胰岛素原基因与两段顺式调控元件(胰岛素生长因子结合蛋白一1基因调节区及丙酮酸梭激酶基因的葡萄糖反应元件区)重组，通过肝脏细胞特异的反式调控因子即转录因子即可实现细胞特异的调控表达。此种调控感受机体生理浓度葡萄糖及胰岛素的刺激，实现按生理需要调控胰岛素分泌。为糖尿病最终应用于临床奠定了坚实的基础。把外源基因转人靶细胞的技术主要有:化学物理方法:DNA与一磷酸钙共沉淀法，脂质体包埋法，脂质体细胞融合法，显微注射法，电穿孔法;病毒载体的方法:RNA病毒和DNA病毒载体等。本实验采用了逆转录病毒载体转染法，其介导的基因转移具有高效转移，高整合，高表达和宿主细胞范围广的优点，是常用的基因转移系统，其感染
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R346

【共引文献】