T7噬菌体展示筛选系统筛选与p38MAPK及PRAK相结合蛋白

发布时间：2020-09-23 07:29

　　 p38 MAPK是一种应激激活的丝／苏氨酸蛋白激酶，属于MAPK超家族；目前已发现p38 MAPK家族成员有p38(α)、p38 β、p38 γ、p38 δ，分子量约38～40kD。各个亚型之间的不同功能部分与它们在不同组织的表达，激活方式以及底物特异性相关，不同的p38能被细胞应激(紫外线辐射、渗透性休克、热休克、脂多糖、蛋白合成抑制剂)、某些细胞因子IL-1、TNF-α等激活。细胞应激或细胞表面受体与配体的结合介导p38的激活是一种由特定的激酶通过一种高度保守的三级激酶模式(MKKK／MKK/MAPK)而激活的过程。p38是在苏氨酸(Thr)-甘氨酸(Gly)-酪氨酸(Tyr)活化基团中Thr和Tyr双位点上被磷酸化而激活。能磷酸化激活p38的蛋白激酶有MKK3和MKK6。这两种MKK都能被TAK1、ASK1、SPRK、PAK等激活。 p38被激活后将磷酸化一些特异性底物。目前已发现的底物有多种转录因子，如ATF2、CHOP10、MEF2C、Max；此外还包括一些蛋白激酶，如MAPKAPK 2和3、PRAK、MNK 1和2等。由于p38能磷酸化许多不同的底物，因而有理由认为p38具有许多不同的生物学功能。p38 MAPK的激活涉及到细胞生长、细胞周期、细胞凋亡等过程。同时，也涉及到炎症和应激反应的调控、转录因子的调控、细胞骨架重组等，甚至在某些疾病过程都有重要作用，如在心肌肥大、缺血／再灌注损伤、神经元病理、感染性疾病、创伤愈合和组织重塑中均有p38参与。 PRAK是一个受p38调控的丝氨酸／苏氨酸激酶，由471个氨基酸组成，分子量约54kD；在细胞应激和致炎因子的刺激下，细胞中的PRAK能被p38磷酸化激活，被激活的PRAK转而磷酸化激活小分子量热休克蛋白27(sHSP27)，从而介导细胞骨架重构，参与细胞应激反应。但对其具体机制却知之甚少。另外，内源性PRAK主要定位于胞质中；而外源性表达的PRAK则主要位于核中。序列分析表明，PRAK同时含有一个核输出信号(NES)和一个核定位信号(NLS)，而这两者对于PRAK的穿梭而言是必不可少的。在受到刺激后，由于PRAK入核减少而出核增加，导致核中的PRAK减少。PRAK的入核不依赖于p38的激活，但出核则依赖于p38对其的磷酸化。因而，PRAK的亚细胞分布由多种因素决定，而且PRAK在胞质与胞核之间的穿梭到底介导哪些细胞功能也不清楚。从以上可以看出，p38MApK信号通路具有广泛的和复杂的生物学作用，但这也仅仅是该通路的部分功能，仍有许多功能有待揭示。为了进一步了解p38 MAPK及其下游激酶PRAK的重要作用，我们利用一种新的筛选技术T7噬菌体筛选系统筛选了与p38及PRAK相结合的蛋白。噬菌体展示技术是寻找与靶蛋白(已知蛋白)有结合关系的多肤或蛋白的有效方法。该方法的原理是以靶蛋白为诱饵，通过结合一洗脱一扩增3个步骤，筛选噬菌体cDNA文库，获得与靶蛋白结合的多肤或蛋白。T7噬菌体筛选系统具有简单、快速地筛选到相当长度的多肤或蛋白质的优点，为研究蛋白质相互作用提供一个强有力的手段。经过筛选，我们共得到46个与p38结合的预选蛋白，13个与PRAK 结合的预选蛋白，非常有趣的是我们用这两个蛋白均筛选得到一个相同的蛋白HPeZ(h切叮an homolog of polyeombZ，HPCZ)。HpCZ是哺乳类动物Polycombgro叩(PcG)家族成员。Polycomb家族在果蝇中研究较多，具有抑制基因转录的作用，而且经常和与其相拮抗的Trithorax grouP (TrxC)家族成员一起，通过多种机制如核昔酸修饰、染色质重构及与转录因子相互作用来调控基因转录。现有实验证实，哺乳类的几个PcG 成员在胚胎的发育、细胞增殖、细胞周期调控以及肿瘤的发生中具有重要作用。我们亚克隆了两个HPCZ的真核表达载体:pEGFP一cZ旧PcZ与 peDNA3一fl眼肛peZ，并将pEJP一CZ舰pCZ转染人胚肾293细胞 (H EK293)中，发现增强型绿色荧光(E GFP)主要存在于核内，并且在核的某些区域有较强EGFP的不连续聚集，呈颗粒状分布;随后我们探讨了HPCZ对应激刺激的反应，发现细胞内过表达的EGFP旧PCZ仅对山梨醇(sorbitol)引起的高渗有反应，由刺激前的聚集于核内发展为刺激后的弥散分布于整个细胞，而对LPS、NaAs02、HZo:刺激并未出现这种反一4一应;我们将pcDNA3一flag肘PCZ转染HE心93后，给予50比itol刺激，利用核质分离和westem blot技术得到进一步证实;虽然，我们在筛选过程中用p38和PRAK同时得到HPCZ，但研究发现p38特异性抑制剂 SB203580不能阻止sothitol引起HPCZ的出核效应。综上所述，我们利用T7噬菌体展示筛选系统，以P38M”K和PRAK 为靶蛋白，筛选了人肝和人肺文库，得到多个可能与二者相互作用的蛋白，为下一步深入研究p38信号通路的复杂功能和调节机制提供新的切入点;同时将筛选到的一个可能与P38 MAPK和PRAK均有结合的蛋白 HPCZ，亚克隆到两个真核表达载体上，并对其在真核细胞中的表达定位及与应激刺激关系作了初步探讨。
【学位单位】：第一军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R341

【参考文献】