人源性天然单链抗体库的构建

发布时间：2020-10-11 20:32

　　 抗体在现代医学中起着重要的作用，被广泛地运用于实验室研究、疾病的诊断与治疗。噬菌体抗体库技术为人单抗的制备开创了一个全新的技术领域，它使用聚合酶链延伸反应(PCR)方法，把免疫球蛋白全套可变区基因扩增出来，重组到原核表达载体中，并通过与噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白，使抗体片段表达于噬菌体表面，这样可用类似亲和层析的方法，筛选特异性的可变区基因。这样就可以不经过杂交瘤、甚至不经过免疫就可获得特异地结合不同抗原的抗体片段。本实验用PCR，从正常人外周血中分离淋巴细胞，克隆出抗体重链和轻链的可变区基因，重组到表达载体中，构建了人源性噬菌体抗体库。 一、抗体轻、重链基因的扩增。这一部分主要包括以下步骤：①淋巴细胞的分离②总RNA的提取③mRNA的纯化④反转录⑤PCR。结果：共提取出RNA 640μg；mRNA的纯化后得到7.2μg。经过RT-PCR，VH，VL及VK的每一条5’端引物与其相应的3’端引物都成功地扩增出可变区基因片段。 第 四 军 医 大 学 硕 士 学 位 论 文 二、载体酶切、连接、转化条件的优士。较高的酶切效率、连接 及转化效率，对于保证抗体库的纯度和容量的大小是十分重要 的。在这一部分中，主要就这一方面快一探讨。对pDANS分别 用 Xho、Nhe、BssH 11并在不同缓冲条件下进行酶切，其酶 切效率通过电转化的方法进行测定；人pDpNS载体上切下一小 片段，在连接回去，观察载体与片段的连接效率；纯质粒及连接 体系中质粒转化效率的测定。结果：XllOI、Nllll、BSSH IJ的 酶切效率是非常高的，可以满足均建抗体库的要求。而 Sal的 酶切效率却只有 50％左右。XI。O无论是在其最适缓冲液（H h肚r）还是在由低盐缓冲液山，1加殃r）所矫正（每川…体系加 入 IPllM的 NaCI）的体系当中都能够取得较高的酶切效率；载 体与片段的连接效率为 2刁8 x 10s’pg载体，说明如果能够保证 这些片段的两端完全被限制性内切酶听消化，那么要构建一个库 容量为 10’的抗体库，仅需十多次连接和一百多次转化即可；纯 质粒的转化效率一般可达到：IXIO＼5 XIO’转化于；’pgDNA。连 接体系中质粒的转化效率较纯质粒低，而T4DNA连接酶是影响 其转化效率的主要因素。通过热灭话将 T4 DNA连接酶灭活，或 者用酚、氯仿抽提后，体系中的＊＼人转化问题基本可以得到解 决，能够达到与单纯质粒相近的转化效率。 三、PCR产物酶切及连接效率的改进二PCR产物的克隆对于抗体 库的构建是十分重要的一步。但是，由于PCR产物的酶切效率很 低，致使片段两端不能够被完全切开，最终使得PCR产物的克隆 效率较低。这一部分就此问题进行了探讨。发现：①两端完全切 开的片段与载体连接，每… l连接产物可以得到约 l叫．4 XIO’个 克隆，完全可以满足抗体库的要求。所以，关键问题就是如何能 第 四 军 医 大 学 硕 士 学 位 论 文 够得到两端被完全消化的可变区基因片段：②P＊R产物直接酶切 效率很低，即使在酶切位点之外填加了长达36hp的保护序列，并 且把消化时间延长至12小时，结果也只有50％左右的片段被完 全消化切开。因此，增加保护序列的长度或者延长酶切的时间并 不能够解决＊＊R产物难以酶切的难题：③同样，P＊R产物经过酶 切后直接与载体连接的效率很低；④而PCR产物与T载体连接 的效率较高，可满足抗体库的要求厂⑤将pSP73改造后制备成 丁载体。 四、人源性天然抗体库的构建。首先用前面阐述的T载体方法， 先将轻链、重链可变区基因片段分别克隆入PSp73＊中，构建出 轻链库和重链库。然后，将轻链片段从PSp73＊上切出来，克隆 入pDANS中，再将重链片段从PSp73＊上切出来，并克隆入己 有轻链插入的pDANS中。这样，经过这两步分步克隆，就构建 出了人源性单链抗体库。下一步，再经过噬菌体挽救，就可以将 这一抗体库呈现在噬菌体的表面了。 经过以上四个部分，一个人源性单链抗体库就建成了。今后， 应用相应的抗原物质，可以对其进行有目的的筛选，就可获得具 有一定亲和力的抗体c
【学位单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2002
【中图分类】：R392
【文章目录】：
英文缩写
中文摘要
英文摘要
文献回顾
前言
第一部分 抗体轻、重链基因的扩增
    材料与方法
    结果
    讨论
第二部分 载体酶切、连接、转化条件的优化
    材料与方法
    结果
    讨论
第三部分 PCR产物酶切及连接效率的改进
    材料与方法
    结果
    讨论
第四部分 人源性天然抗体库的构建
    材料与方法
    结论
    讨论
研究总结
致谢
参考文献

【参考文献】

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1 苏明,窦科峰,赵爱志,李福洋;提高柱式胶回收试剂盒DNA回收效率的最佳条件[J];第四军医大学学报;2002年06期

2 万泽生,王海涛,姜绍谆;从人外周血B淋巴细胞中应用PCR扩增人抗体基因[J];细胞与分子免疫学杂志;1997年01期

3 张广发，王琰，王雅明，徐建军，刘华;噬菌体抗体库的构建及抗肿瘤单抗的筛选[J];中华肿瘤杂志;1995年04期

本文编号：2837084