全人源单链抗体库噬菌体展示技术的建立

发布时间：2020-10-14 22:03

　　 目的建立全人源单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)库的噬菌体展示技术。方法采集100名健康老年志愿者的外周血,5 mL/人,混合所有全血并分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),抽提RNA,反转录合成cDNA,以其为模板,IgG类抗体基因为引物,PCR扩增获得重链可变区片段(V_H)和轻链可变区片段(V_L),然后以V_H和V_L为模板,经重叠PCR获得scFv,经sfiⅠ酶切,插入pComb3xss载体,电转后获得一定容量的抗体库;加入辅助噬菌体VCSM13过夜培养,上清液经PEG-NaCl沉淀,无菌PBS重悬噬菌体沉淀,即完成噬菌体抗体库的构建;采用Phage ELISA法进行噬菌体单克隆抗体的特异性鉴定。结果成功构建了库容为2. 6×10~9的噬菌体抗体库;随机挑选的100个噬菌体单克隆中共筛选到2个疑似H1N1株HA抗原的噬菌体抗体。结论成功构建了噬菌体抗体库的技术平台,可用于各类功能抗体的筛选。
【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 样本
    1.2 质粒、细胞及噬菌体
    1.3 主要试剂及仪器
    1.4 引物设计及合成
    1.5 目的基因片段VH及VL的扩增
    1.6 sc Fv的扩增
    1.7 TA克隆
    1.8 克隆产物的酶切鉴定
    1.9 噬菌体抗体库的制备
    1.1 0 噬菌体抗体库的富集筛选
    1.1 1 噬菌体滴度检测
    1.1 2 噬菌体单克隆抗体特异性鉴定
2 结果
    2.1 VH和VL扩增产物的鉴定
    2.2 scFv扩增产物的鉴定
    2.3 克隆产物的鉴定
    2.4 噬菌体抗体库的富集筛选
    2.5 噬菌体单克隆抗体的特异性
3讨论

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本文编号：2841255