A型产气荚膜梭菌α毒素基因的克

发布时间：2020-10-17 06:39

　　 α毒素是A型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type A，CPA)引起气性坏疽的最主要致死因素，也是重要的生物毒素战剂，目前尚无有效的防治方法。克隆A型产气荚膜梭菌α毒素基因，实现在大肠杆菌中的高效表达，研究重组毒素的生物学活性及免疫学活性，对α毒素的检测、疫苗及抗毒素的制备具有重要意义。 用PCR方法从A型产气荚膜梭菌菌株NCTC64609中扩增到了α毒素全基因(cpa1229基因)及C端片段(cpa408基因)，将两片段分别克隆至pMD18-T Vector测序鉴定后，置于含PRPL启动子的原核表达载体pBV220的受体菌DH5α中，经42℃温度诱导，cpa408基因在分子量约15KD处得到了高效表达，表达量达43.75％且表达产物主要以可溶形式存在。经Western blot鉴定，表达蛋白能被抗α毒素血清所识别。将表达产物经80％饱和硫酸铵一次沉淀后，进行透析，上凝胶过滤层析柱分离纯化，得到了纯度95％以上的表达目的蛋白。用纯化的表达产物，腹腔注射免疫昆明小鼠，进行免疫保护实验，结果免疫组8只小鼠全部存活，得到了100％的保护，而对照组8只小鼠全部死亡。同时，多点肌肉注射免疫SPF级30周龄产蛋鸡；收集免疫后鸡每周所产蛋，混和卵黄液提取鸡卵黄抗体IgY后，取适量样品，ELISA法测定卵黄液中抗体滴度值，结果所制备的抗体滴度一般在1：6400至1：12800之间，最高值达1：25600；以双向免疫扩散和ELISA方法，用IgY和标准抗α毒素血清检测cpa408表达蛋白及A型产气荚膜梭菌NCTC64609浓缩培养上清，两者均能与IgY及标准抗α毒素血清特异反应。 昆明小鼠主动免疫保护实验及鸡卵黄抗体制备实验显示，cpa408基因表达产物具有良好免疫原性，其免疫昆明小鼠后产生的抗体对小鼠具有保护作用，从而为下一步α毒素疫苗及抗毒素的研究奠定了基础，所制备的IgY抗体为α毒素的检测提供了可靠的材料。
【学位单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2003
【中图分类】：R392.1
【部分图文】：

1.1cpa基因PCR扩增产物鉴定1.cpa1229基因PCR扩增产2.cpa4OS基因PCR扩增产物M:DLZ，000DNAMarker(2000，1000，750，500，250，IOObpa基因快速连接后，转化至受体筛选培养，挑取白色菌落PCR切鉴定，结果切出1229bp大小阳性克隆质粒中含有Cpa1229基

琼脂平板进行蓝白菌落筛选培养，挑取白色菌落PCR扩增鉴定，同时提取质粒并进行EcoRI/PStl双酶切鉴定，结果切出1229bp大小及408bp大小的外源基因片段(见图1.2)，表明阳性克隆质粒中含有Cpa1229基因及cPa408基因片段。

随机挑取克隆菌进行PCR扩增，阳性者，提取质粒进行双酶切鉴定，结果见有408bp及1229bp大小的片段，说明cpa408基因片段及Cpa1229基因片段已克隆至表达载体中，见图1.5。图1.5重组表达质粒pBV/cpa408双酶切鉴定1.表达质粒pBV22O;.重组表达质粒pBv/epa4OSEeoRI、Pstl双酶切:.重组表达质粒pBV/epa1229EeoRI、Pstl双酶切;M:DL2000Marker(2000，1000，750，500，250，IOObp)
【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 张智清,姚立红,侯云德;含P_RP_L启动子的原核高效表达载体的组建及其应用[J];病毒学报;1990年02期

2 赵宝华,许崇波,冯书章,朱平;抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体基因的表达[J];中国兽医学报;2000年04期

3 许崇波,朱平,姚湘燕,王卓,冯书章,马从林,孟锐奇;产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因在大肠杆菌中的高效表达[J];中国兽医学报;1999年01期

本文编号：2844432