细胞表面钙调素结合位点的定位及钙调素定量方法研究

发布时间：2020-10-23 19:35

　　 钙调素(calmodulin，CaM)是一种广泛存在于真核细胞中的Ca~(2+)结合蛋白，CaM-Ca~(2+)作为细胞内信号转导途径中的主要信号分子，介导调控由Ca~(2+)引起的一系列生理生化反应，调节细胞的增殖、分化、运动等过程。近年来的研究发现，钙调素也同样存在于动、植物细胞外，具有促进细胞增殖，神经轴突生长，抑制肿瘤坏死因子的释放，以及促进中性粒细胞蛋白酶分泌等功能，CaM类似于细胞因子和肽类激素的特征，具有细胞外信号功能。有关细胞外CaM的作用机制目前尚不清楚。推测细胞表面可能存在的钙调素结合蛋白(calmodulin-binding proteins, CaMBPs)，是介导细胞外CaM和胞内信号转导的桥梁，起到传递细胞外CaM信号的作用。用免疫电镜定位技术，证实细胞表面CaMBPs的存在和观察其在不同细胞表面的分布特征，将有助于深入了解细胞外CaM的作用机制，及其与细胞增殖的关系，为疾病的诊断和治疗提供线索。 已发现植物细胞壁存在CaMBPs。为证实哺乳动物细胞表面CaMBPs的存在，本研究用10nm胶体金标记重组人钙调素(金-rhCaM)，分别与人外周血淋巴细胞、小鼠骨髓瘤细胞SP2／0、人胃癌细胞MGC803在体外反应24h后，用透射电镜观察，结果发现上述三种细胞表面均可见散在金颗粒分布，用金标记BSA代替金标记钙调素与上述细胞作用，或淋巴细胞预先用未标记钙调素封闭后再与金-rhCaM反应，透射电镜观察，细胞表面均未见金颗粒分布。提示在人外周血淋巴细胞、小鼠骨髓瘤细胞SP2／0和人胃癌细胞MGC803表面存在rhCaM结合位点(Camodulin-binding site, CaMBS)。从透射电镜结果中也发现，小鼠骨髓瘤细胞(SP2／0)和人胃癌细胞(MGC803)表面CaM结合位点的密度要高于正常人外周血淋巴细胞，提示细胞膜表面CaMBS的分布可能与肿瘤细胞生长相关。 长期以来，钙调素被认为是真核细胞的信号转导分子。但近年来的研究发现，原核细胞中也存在钙调素样蛋白。我们此前的工作也证实外源性CaM可以促进结核分枝杆菌生长。推测原核生物的细胞壁也可能存在CaM结合位点。用金 第__军医大学领一卜学位论文 一rllCaM与新鲜培养的卡介苗(减毒牛结核分枝杆菌)进行反应，透射电镜观察 发现结核分枝杆菌细胞壁存在钙调素结合位点。 大量研究表明，CaM结构与功能的异常以及细胞内CaM含量的变化与某些 疾病的发生发展密切相关，检测细胞内外CaM的含量及其与疾病的关系，将有 助于进一步探讨CaM的生物学功能及其在某些疾病的发生发展中的作用机制和 意义。由于CaM分子结构在进化上的保守性，难以制备特异性的优质抗体，至 今还没有理想的CaM检测试剂盒适合于临床常规应用。本研究在研制rhCaM和 兔抗CaM抗体的基础上，通过对聚苯乙烯反应板进行紫外线照射处理;改善抗 原固相化条件，建立了简便、快速、准确的竞争性ELISA定量方法，经方法学 考核，该法具有较高的敏感性，检测CaM的最低下限为4Ong/ml:重复性较好， 可用于CaM的定量研究。对淋巴细胞性白血病9例、非淋巴细胞性白血病7例、 淋巴瘤7例和82例健康献血员外周血单个核细胞细胞内CaM含量测定结果表 明，三组患者中外周血单个核细胞内CaM含量分别为1 349.3士206.38fg/cell、 556.06士108.02 fg/cell、1746.05士547.84fg/c ell，显著高于正常对照组(107.16土56.07 倒cell)(P0.01)。提示白血病和淋巴瘤患者单个核细胞内CaM表达水平显著 升高。 特异性抗体的制备是建立高特异、灵敏的ELISA检测技术的重要环节。由于 CaM抗原分子量小，无种属性差异，很难免疫动物获得高效价、高亲和力的特 异性抗血清。因此也限制了ELISA方法的敏感性。噬菌体抗体库技术的发展， 为某些难以免疫动物产生特异抗体的抗原，提供了生产单克隆抗体的另一条可行 途径。为此，我们采用噬菌体显示技术，利用重组人钙调素为筛选抗原，从人源 性噬菌体抗体库中筛选抗CaM特异性抗体，以期得到高效、特异的抗CaM抗体。 从天然抗体库中筛选抗原特异性抗体，筛选效率通常较低，成功率远比从免疫抗 体库中筛选低得多，技术难度较大。我们经过多次筛选方案改进，得到了阳性噬 菌体抗体克隆。用ELI SA试验、钙离子敏感性反应试验、胶体金斑点试验(反 相)证实其抗原特异性。得到了抗原结合活性较强的人源性CaM单链噬菌体抗 体。我们的改进方案可能对其它抗原的抗体库筛选具有参考意义。
【学位单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R341
【部分图文】：

体(由噬菌体基因改造而成)中，外源性蛋白基因直接插入噬菌体基因中，以寡价(p川融合)和多价(p姗融合)展示，因此展示水平较高。如果噬菌体上的p111蛋白都是融合的，空间位阻将阻碍plll与性菌毛结合，会导致感染能力下降。而p硼融合表达系统能容纳的肤链长度有限，妨碍噬菌体的组装。噬菌粒载体(是噬菌体与质粒的杂合体)更适合于展示抗体分子，容易导入新的基因，连接转化效率高，能获得较大的库容‘。因此，噬菌体抗体库多采用噬菌粒作为载体。3.2技术流程将Fab、ScFv的基因与少量衣壳蛋白基因p川相接，插入噬菌粒载体，转染表达F菌毛的大肠杆菌，在宿主菌内合成后，抗体融合表达在plll的N端，借助信号肤穿膜作用，进入膜间隙。在辅助噬菌体超感染后，这些抗体片段一plll融合蛋白被包装于噬菌体尾部。同时由于辅助噬菌体的复制缺陷，噬菌粒的DNA被优先包装进入噬菌体内核，因此携带有表达载体的宿主菌就会释放出带有抗体片段的噬菌体颗粒，并具有再次感染宿主菌进行复制的能力(图1)。
【参考文献】

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本文编号：2853454