具有特异免疫反应活性的弓形虫重组SAG1抗原及其单克隆抗体的制备、鉴定和初步应用

发布时间：2020-10-24 00:53

　　 弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生的医学原虫，能感染几乎所有恒温动物(包括人类)，引起弓形虫病，全世界近1／3的人口受到威胁。弓形虫是一种机会性致病原虫，在免疫功能正常的宿主体内通常形成包囊，造成隐性感染；但当宿主免疫功能下降时(如肿瘤患者、器官移植者及AIDS患者等)，弓形虫可在宿主体内播散引起弓形虫病甚至导致宿主死亡。妇女在妊娠期初次感染弓形虫可引起流产、畸胎、死胎，或引起胎儿先天性弓形虫病，表现为智力低下、视网膜脉络膜炎、失明等，这些症状可在胎儿出生时或是成长过程中出现。弓形虫感染也是家畜／家禽流产、畸胎、死产的主要原因之一，对畜牧业生产危害严重。因此，弓形虫病的诊断，尤其是弓形虫现症感染的及时诊断成为弓形虫病防治工作的重点。 目前，国内外普遍采用免疫学方法检测血清中的弓形虫IgG和IgM，所用抗原多是从感染动物中收集或经组织／细胞培养的弓形虫速殖子抗原。但这种制备速殖子抗原的方法昂贵费时，纯度低，试剂盒批间差异大，不易标准化。而在原核表达系统中表达特异的目的蛋白，因蛋白产量高、操作简单、费用低廉而被许多研究者选用。SAG1蛋白是弓形虫速殖子期特异性抗原，在不同虫株之间具有具有高度的保守性，大量实验证明SAG1蛋白具有良好的免疫原性，是弓形虫病诊断和疫苗研究的重要候选抗原分子。但SAG1蛋白是一个高度构象依赖的蛋白，其空间结构的形成主要依赖二硫键的正确连接。原核表达系统(如大肠杆菌)缺乏蛋白质翻译后的修饰功能，因此以往在大肠杆菌中获得的重组 SAGI蛋白大都形成包涵体，表达产物由于错误折叠而不具有特异的免 疫反应性，需经复杂的变性、复性过程才能恢复部分活性。本室陈晓光 等在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达了SAGI蛋白的成熟片段(切除 了N末端的信号肤和C末端的疏水尾)，复性后可识别弓形虫感染血 清，但复性效率较低。 本研究尝试在大肠杆菌中进一步以可溶性形式表达成熟SAGI蛋白 片段，期待表达的重组蛋白无需复性即能具有良好的免疫活性，探讨重 组蛋白作为新型诊断抗原的可能性;并且进一步筛选针对重组SAGI蛋 白的单克隆抗体，探讨单克隆抗体检测弓形虫抗原的价值，为建立一套 弓形虫感染的新型诊断体系打基础。 目的:1.克隆SAGI基因截短片段，获取以可溶性形式在大肠杆菌 中表达，具有特异免疫反应活性的重组SAGI蛋白。 2.制备抗重组SAGI蛋白的单克隆抗体，进行鉴定、纯化， 为研发弓形虫Dipstick诊断试剂条打基础。 方法:1.制备弓形虫速殖子特异的免疫兔血清。 2.利用限制性内切酶从本室构建的pET3Oa一SAGI中获取 SAGI基因的截短片段，克隆到经过同样酶切的pET32a中，构建表达型 重组质粒pET32a一tSAGI，并对重组质粒进行酶切及测序鉴定。 3.优化工程菌pET32a--tSAGI/BL21的表达条件，大量诱导表 达后对重组蛋白进行纯化。 4.用弓形虫速殖子免疫兔血清检测重组蛋白的免疫反应性， 并用重组蛋白对人血清进行检测。 5.应用杂交瘤技术，将小鼠SPZ/0细胞与经重组SAGI蛋白 免疫的小鼠脾细胞融合，筛选抗重组SAGI蛋白的单克隆抗体，并进行 鉴定和纯化。 结果:1.克隆了截短形式的SAGI基因，构建了表达型重组质粒 pET32a一tsAGI，测序结果显示读码框架正确。 2.在大肠杆菌中以可溶性形式表达了SAGI基因截短片段， 与弓形虫速殖子免疫兔血清的Wester~blot结果显示重组蛋白具有良 好的免疫反应性。用重组SAGI蛋白检测人血清，结果显示该重组蛋白 在弓形虫病诊断方面具有良好的应用前景。 一4- 3.筛选了五株针对重组SAGI蛋白的单克隆抗体，Western- blot结果显示五株单克隆抗体与弓形虫速殖子SAGI抗原具有良好的免 疫反应性，并且具有两个不同表位。 结论:1.制备了高效价的弓形虫速殖子免疫兔血清，已用于本室 表达的弓形虫重组蛋白的免疫活性鉴定。 2.在大肠杆菌中以可溶性形式表达了SAGI基因的截短片 段，经免疫反应性鉴定和初步应用试验，表明重组SAGI蛋白具有良好 的免疫反应性和应用前景。 3.制备了5株抗截短形式重组SAGI蛋白的单克隆抗体，经 鉴定5株单抗均能识别天然SAGI蛋白，具有潜在的诊断价值。
【学位单位】：第一军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R392
【部分图文】：

37KDa、34KDa、31KDa、ZsKDa、22KDa，与张艳等129]的结果基本一致。图1一4兔血清与弓形虫速殖子抗原的Western一blot结果1:弓形虫速殖子免疫兔血清;2:正常兔血清;3:低分子量标准蛋白Fig.l一4Western一blotanalysisofrabbltseravstaehyzoiteantigenofT.go雌diilanel:rabbitseruminununizedwithtachyzoiteantigenofT.gondii:laneZ:non刀alrabhitserum:lane3:Lowmoleeularweightmarker一24-

图1一3弓形虫速殖子免疫兔血清效价测定Fig.1一3Titereurvesofrabbitserellr庄nunizedwithtachyzoiteantigenofT.gondii(三)弓形虫速殖子抗原与弓形虫速殖子免疫兔血清的West娜一blot结果弓形虫速殖子免疫兔血清与弓形虫速殖子进行Westem一blot，DAB显色后可见7条反应区带，主要区带的相对分子量为55KDa、43KDa、37KDa、34KDa、31KDa、ZsKDa、22KDa，与张艳等129]的结果基本一致。图1一4兔血清与弓形虫速殖子抗原的Western一blot结果1:弓形虫速殖子免疫兔血清;2:正常兔血清;3:低分子量标准蛋白Fig.l一4Western一blotanalysisofrabbltseravstaehyzoiteantigenofT.go雌diilanel:rabbitseruminununizedwithtachyzoiteantigenofT.gondii:

重组质粒经上海联合基因公司测序，插入子序列经DNAMAN软件与己发表的弓形虫RH株SAGI基因序列比较，同源性为99%。插入子序列在第9位由C突变为A，在第288位由G突变为A(见图1一6)。第9位的突变是由于插入子序列在设计的时候为了增加一个Aflll酶切位点特异设计的无义突变，而第258位的突变怀疑为测序错误。为进一步证一25-
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本文编号：2853784