人胚胎骨髓间充质干细胞在大鼠体内分化为肝细胞的研究

发布时间：2020-10-26 20:54

　　 肝脏是人类最重要的能量代谢、生物合成和物质转化器官。严重肝脏疾病往往需要原位肝移植(OLT)才能够获得根治性的治疗,但由于供肝数量有限、手术复杂且费用高昂等原因原位肝移植手术难以广泛开展。肝细胞移植具有以下优点:①一个供体可给予多个受体提供细胞;②移植技术简单;③供肝细胞免疫原性低且可冻存;④可重复移植,如移植失败,对受体的影响也十分微小。但肝细胞移植也面临人类肝细胞来源有限,而异种移植(Xenotransplantation)免疫排斥反应剧烈等制约因素。肝干细胞具有多向分化能力,可分化为肝细胞与肝非实质细胞,肝干细胞研究的深入开展为肝细胞来源开辟了新途径。骨髓间充质干细胞(MSC)具有多向分化能力,被称作肝外源性肝干细胞。MSC在肝内可演变为卵圆细胞、肝细胞及胆管细胞。MSC的这些特性使利用患者自身MSC进行体外诱导分化,然后自体细胞移植成为可能。从而可以同时解决移植细胞来源匮乏和移植后免疫排斥这两个肝细胞移植面临的主要问题。 目的:1.分离人胚胎MSC并体外培养,摸索人胚胎MSC的分离、培养方法。2.构建肝损伤合并自身肝细胞再生抑制动物模型。3.将人胚胎MSC移植入自身肝细胞再生抑制的肝损伤大鼠脾脏内,观察其在大鼠体内的分化演变,为肝细胞移植治疗肝衰竭奠定实验基础。 材料和方法:1.用密度梯度离心法分离流产胎儿的MSC,用MEM培养基体外培养后检测人胚胎MSC含量和活性。2.用AAF灌喂大鼠后行肝部分切除,分时段检测肝功。3.将人胚胎MSC移植到肝损伤合并自身肝细胞再生抑制大鼠脾脏,术后分时段取脾脏、肝脏免疫组化染色了解人ALB、CK 8、CK 18、CK19的表达情况,糖原染色了解细胞内糖原含量。 结果:1. 分离获得的人胚胎MSC含量为85%～93%。体外培养7天后人胚胎MSC含量大于93%,细胞活性在95%以上。2.AAF灌喂后肝损伤大鼠的肝再生抑制明显,肝功能恢复缓慢。3.人胚胎MSC移植后10天大鼠脾脏的人CK8、CK18、CK19免疫组化染色即可见阳性细胞,移植后2周大鼠脾脏组织内人ALB免疫组化染色可见 国家自然科学基金资助(30070347,30100080)。 WP=8 阳性细胞,以后至12周均有阳性显示。未进行MSC移植的对照组未见阳性细胞。人胚胎MSC移植后大鼠肝脏免疫组化染色结果和脾脏相似,染色阳性细胞主要位于移植后大鼠肝脏的汇管区,这也说明其来源是由脾脏经门静脉进入肝脏。对照组肝脏未见阳性细胞。人胚胎MSC移植后2周大鼠脾脏糖原染色可见阳性,至第12周仍可以检测到阳性细胞,显示分化后细胞具有一定的糖原合成能力。 结论: 1.用密度梯度离心法分离后MEM培养基体外培养的人胚胎MSC纯度高,生物活性好。 2.AAF灌喂后肝部分切除大鼠肝细胞再生抑制明显,是较好的肝损伤合并自身肝细胞再生抑制动物模型。 3.人胚胎MSC能够在自身肝细胞再生抑制的肝损伤大鼠脾脏内分化为肝细胞。人胚胎MSC移植后有部分迁移至肝脏,并分化为肝细胞。
【学位单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R329.2
【部分图文】：

(二)试剂配制0.2% AAF 的配制：将 200mgAAF 粉剂溶于 100m℃冰箱保存。(三)主要仪器设备常用手术器械及大鼠灌喂针 BCD-199 型冰箱 EQU/04-EVC 型超净台 7020 型自动生化分析仪 三、肝细胞再生抑制的诱导实验组大鼠按 10mg/kg.d 的灌喂剂量灌喂 0.2%的 情况，正常喂食。对照组大鼠正常饲喂。四、大鼠部分肝切除手术实验组、对照组大鼠均行肝左侧叶（约占大鼠全肝禁食，术前 2 小时禁水。
【参考文献】

相关期刊论文 前6条

1 江海洪;王宇明;刘国栋;陈耀凯;李俊刚;赵文利;;小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究[J];第三军医大学学报;2006年06期

2 耿涛;齐念民;;骨髓间充质干细胞三维培养——构建工程组织[J];科技导报;2006年01期

3 郭子宽,唐佩弦,刘晓丹,杨靖清,李秀森,陈小三,毛宁;人骨髓间充质干细胞支持体外造血(英文)[J];中国实验血液学杂志;2000年02期

4 苏瑞军,黄绍良,周敦华,李树浓,梁晓燕;人胚胎骨髓基质细胞的体外培养观察[J];中国小儿血液;1999年01期

5 王宇明，陈国致，董家鸿，袁良平，刘国栋，丁健;分离肝细胞的一种体外灌流法[J];中华消化杂志;1994年03期

6 王英杰，李梦东，王宇明，王小红，聂青和;人肝细胞的微载体培养及其意义[J];中华消化杂志;1997年04期

本文编号：2857515