法舒地尔对UUO大鼠模型IKKβ、IκBα、NF-κBP65及Ⅲ型胶原表达的影响

发布时间：2020-10-31 17:55

　　 目的:肾间质纤维化是各种慢性肾脏疾病(Chronic Kidney Disease,CKD)进行性进展的共同病理基础,其病理学变化是细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的过多沉积,进而导致肾结构的破坏及肾功能的下降。多种细胞、细胞信号转导通路及细胞因子均参与该过程。肾间质纤维化的早期表现为以巨噬细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润,细胞因子、趋化因子增加为主的炎症状态。在炎症反应中产生的多种细胞因子、生长因子及趋化因子及均可作用于成纤维细胞(fibroblasts,FB)引起FB增生活跃以及诱导其发生表型转化,使其合成胶原蛋白能力增加,导致细胞外基质过度沉积,造成肾脏结构重塑,促进肾间质纤维化。核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)是一种很重要的转录因子,在各种细胞外刺激介导的细胞信号转导调控中起核心作用,研究发现多种细胞因子、生长因子及趋化因子的基因表达是通过该因子转录机制来调节的,在肾间质纤维化过程中,能促进多种细胞因子、生长因子及趋化因子的基因转录,进而作用于FB,介导和促进肾间质纤维化的发生和发展。NF-κB的活化主要依赖于经典途径:这种途径依赖IKK(IκB kinase)多聚体磷酸化IκBα(NF-κB抑制蛋白),再通过泛素化降解IκBα,使NF-κB二聚体得以释放,核转位进入细胞核,启动下游基因转录,TNF-α等促炎细胞因子可激活此途径。IKK是一个大的多组分蛋白激酶复合体(700KDa),它包括四个组分,即具有催化活性的IKKα/IKK1、IKKβ/IKK2,和两个辅助蛋白IKKγ/NEMO、IKAP。其中IKKβ是激活NF-κB经典途径的关键亚基,IKKβ可以使IκBα上Ser32和Ser36磷酸化,并诱导其降解,使NF-κB从复合体中解离后转位至细胞核启动下游基因转录。法舒地尔是一种新型异喹啉磺胺衍生物,是目前应用于临床的Rho激酶抑制剂,其具有扩张血管、减少炎症反应、抑制自由基生成等作用,目前广泛应用于心脑血管疾病的治疗。有研究显示:肾间质纤维化中,法舒地尔作为Rho激酶抑制剂通路阻断Rho-ROCK通路对肾间质纤维化的保护作用已被研究,有研究显示其作为异喹啉类抑制剂作用于激酶催化结构域的ATP结合位点发挥作用,对其它蛋白激酶也具有选择性抑制作用,但报道不多,本实验目的是通过建立单侧输尿管梗阻大鼠模型(unilateral ureteral obstruction,UUO),并应用法舒地尔进行干预观察其对IKKβ、IκBα、NF-κBP65、III型胶原表达的影响,探讨法舒地尔保护肾脏,延缓肾间质纤维化的可能机制,为延缓及治疗肾间质纤维化提供新的靶点。方法:将54只SPF级雄性SD大鼠(体重180g±20g)编号后按照随机原则分为三组:A组(假手术组,正常对照组),B组(单侧输尿管结扎组,模型组),C组(法舒地尔组,治疗组),每组各18只。适应性喂养1周后进行手术建立单侧输尿管梗阻大鼠模型,术前12小时各组大鼠禁食水。三组大鼠均于术前1天开始给药,C组给予法舒地尔注射液10mg/(Kg·d)腹腔注射;A组及B组每天给予等容积的0.9%氯化钠注射液腹腔注射。自由摄食水,分别于术后第3、7、14天处死6只大鼠,留取左肾标本,0.9%生理盐水充分冲洗后取中间1/4固定于4%多聚甲醛中,用于病理切片,应用HE和Masson染色技术观察光镜下大鼠肾组织病理改变及肾间质纤维化程度,并应用免疫组化技术测定IKKβ、IKBα、NF-KBP65及Ⅲ型胶原在肾脏组织中的表达。另取部分肾脏组织放入液氮并转移至-80℃超低温冰箱保存,用于行western blot检测NF-κBP65蛋白的表达。所得实验数据用SPSS 20.0统计分析软件进行统计学处理,以均数±标准差(x±S)表示统计结果,应用单因素方差分析对数据进行分析,P0.05表示结果有统计学意义。结果:1大鼠肾脏组织病理学改变1.1肉眼A组肾脏颜色及大小正常,其余各组大鼠肾脏体积均有不同程度增大,输尿管扩张,肾皮质变薄,肾脏及输尿管内有尿液积聚,其中以B组肾脏病变最为明显。1.2光镜下HE染色A组:肾组织结构正常,肾小管及间质未见明显异常。B组:术后第3天,少量炎症细胞局部浸润于肾间质区域,肾小管轻度扩张,无明显纤维组织异常增生;第7天,肾间质有大量炎症细胞浸润,肾小管扩张明显,并可见肾小管萎缩、塌陷,纤维组织异常增生;第14天,可见更多肾小管萎缩,基底膜完整性破坏。C组:术后随时间延长,肾小管间质病变逐渐加重,和同期B组相比,肾小管间质病变程度有所减轻,但仍明显重于同期A组。1.3光镜下Masson染色A组:肾组织相对完整,仅个别区域有少量胶原纤维。B组:术后第3天可见肾小管轻度扩张,肾间质可见少量蓝色胶原纤维沉积,相较于同期A组增多;术后第7天,肾小管扩张明显,并可见萎缩肾小管,蓝色胶原纤维沉积较术后3天增多;术后14天可观察到蓝色胶原纤维沉积明显,并且相互交织成网状。C组:术后随时间延长,肾小管间质病变及胶原纤维表达水平进行性加重、增多,较同期B组的病变程度稍轻,但仍明显重于A组。2免疫组化结果显微镜下观察发现,IKKβ、IκBα、NF-κBP65、III型胶原在各组肾小管上皮细胞及肾间质呈阳性表达,其中NF-κBP65在分析中均针对细胞核中因子的表达变化。由图像分析结果可见B组IKKβ、NF-κBP65、III型胶原在术后3天、7天、14天在肾小管上皮细胞及肾间质表达量逐渐增加(P均0.05),各因子分别与同期A组相比表达增加(P均0.05);B组IκBα随梗阻时间延长,在肾间质表达量逐渐减少(P均0.05),与同期A组相比表达减少(P均0.05)。C组IKKβ、NF-κBP65、III型胶原在肾间质表达随时间延长也逐渐增加(P均0.05),分别与同期B组相比各因子表达减少(P均0.05),但与同期A组相比,表达增加(P均0.05);C组IκBα在肾间质表达随梗阻时间延长逐渐减少(P均0.05),与同期B组相比各因子表达增多(P均0.05),与同期A组比较,表达减少(P均0.05)3 western Blot结果NF-κBP65蛋白:B组目的蛋白的表达量随时间延长逐渐增加(P均0.05),与同期A组相比表达量增加(P均0.05);C组术后各时期目的蛋白表达量随时间延长逐渐增加(P均0.05),与同期B组相比较表达量减少(P均0.05),但仍高于同期A组(P均0.05)。结论:1 IKKβ、NF-κBP65、III型胶原在UUO模型梗阻侧肾脏组织中的表达量增加,且与时间延长呈正相关,而IκBα呈相反变化,提示在肾间质纤维化过程中,NF-κB通路被激活,进一步介导和促进肾间质纤维化的进展。2法舒地尔可能通过抑制IKKβ表达,减少IκBα的磷酸化及解离,下调NF-κBP65的表达,进而减轻III型胶原在肾脏的沉积及表达,从而发挥保护肾脏,延缓肾间质纤维化进展的作用。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：R692;R-332
【文章目录】：
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材料与方法
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附表
讨论
结论
参考文献
综述 Rho小G蛋白与肾间质纤维化的研究进展
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1 张成果;;盐酸法舒地尔对维持性血液透析患者血管内皮功能的保护作用[J];实用医学杂志;2014年21期

本文编号：2864301