高血压致大鼠心衰模型中心室肌细胞钙信号研究

发布时间：2020-11-07 14:20

　　 目的:建立大鼠高血压致慢性心力衰竭模型,按照分组进行心肌细胞快速分离,在共聚焦显微镜下观测钙信号及单位释放事件钙火花,并通过研究与兴奋收缩偶联相关蛋白Junctophilin-2(JP-2)及钙回摄相关蛋白SERCA2a蛋白量的变化与钙火花变化的相关性。探讨高血压致慢性心力衰竭的演变过程及在其在病理状态下钙信号变化及其钙循环过程的相关机制变化。方法:1.将实验用大鼠按照随机原则分成两组,心衰模型组(n=40)与假手术对照组(n=26)。2.将心衰模型组大鼠采用腹主动脉缩窄法(TAC)建立压力超负荷高血压致心衰模型。假手术对照组只开腹穿线,不结扎,其他同法操作。3.对术后成活的大鼠定期进行尾动脉血压监测及酶联免疫ELISA法检测心衰标志物BNP的表达量,用于判断确定高血压致心衰模型是否成功。4.造模4周初步成功后将两组大鼠分别于术后的4周、6周、8周、10周、12周急性获取心脏,消化获得单个心室肌细胞,并用于后续检测。5.激光共聚焦显微镜与膜片钳联用,观察并记录心室肌细胞钙活动及单位释放事件钙火花的发生。6.蛋白印记法检测心肌细胞兴奋收缩偶联结构蛋白JP2及钙回摄蛋白SERCA2a随着心衰的发展的表达情况,评估高血压心衰发展过程中的结构变化。结果:1.大鼠术后体征及高血压造模成功率手术成功的大鼠在3~6h内能够恢复清醒,12h左右可以进食,精神状态良好。心衰模型组的成活率为70.0%,在成活的模型大鼠中复制高血压成功率为89.2%;假手术组大鼠成活率为96.1%。2.大鼠术后尾动脉压监测结果大鼠正常血压在13~15kpa左右,在手术完成初期,衰模型组血压与假手术组大鼠的血压差异不明显(P0.05);术后第21天,心衰模型组血压明显高于对照组,且有统计学意义(P0.05);术后第28天,心衰模型组血压持续上升(P0.05),并高于对照组血压(P0.05);术后56天、63天模型组血压出现下降(P0.05),此时血压值仍然高于对照组(P0.05);术后84天,模型组大鼠血压持续下降(P0.05),血压值与高于对照组(P0.05)。对照组组间比较没有差异(P0.05)。3.心衰标志物B型脑钠肽(BNP)检测结果大鼠心衰模型组BNP水平在第4周时明显升高,心衰模型组的血浆BNP水平明显高于对照组(P0.05),同时期心衰模型组大鼠BNP水平高于对照组(P0.05);心衰组的BNP水平随着心衰的进程逐渐升高(P0.05),组间差异明显;4.大鼠急性分离心肌细胞结果状态良好的单个心肌细胞呈杆状,细胞成活率在80%左右。在显微镜下观察,60%以上的细胞呈明显的长杆状,活性良好。5.心肌细胞钙火花形态特征观察结果与假手术组对比,最初两组观察到的钙火花差异不是很明显(P0.05);随着心衰的发展,心衰模型组的心肌细胞观察到的钙火花在时空形态上都有明显的差异,心衰模型组的钙火花幅度降低(P0.05)、达峰时间延长(P0.05)、持续时间延长(P0.05)。随着心衰的发展,细胞结构发生改变,心肌细胞对于电位逐渐反应失敏,结构决定现象,钙火花发生变化有其结构的改变。6.Western blot检测结果心衰模型组大鼠检测结果显示,与假手术组相比,心衰模型组的大鼠在第4周JP2蛋白就表达水平不变(P0.05),第8周模型组蛋白表达低于对照组的蛋白表达(P0.05);随着心衰的进程发展,心衰模型组大鼠蛋白表达量逐渐下降(P0.05),到第10周、12周时,蛋白表达没有差异性(P0.05);对照组间稳定表达,没有差异性(P0.05)。SERCA2a蛋白印记结果显示,心衰模型组的大鼠在第4周SERCA2a蛋白就表达水平不变(P0.05),第8周模型组蛋白表达低于对照组的蛋白表达(P0.05);随着心衰的进程发展,心衰模型组大鼠蛋白表达量逐渐下降(P0.05),到第10周、12周时,蛋白表达没有差异性(P0.05);对照组间稳定表达,没有差异性(P0.05)。结论:1.采用腹主动脉缩窄结扎可以很好地的复制大鼠高血压致心衰模型,与文献报道的相比,大鼠的成活率高,造模成功率也高。2.心衰模型组大鼠血压呈规律变化,血压在一定时间内保持高压,并在心衰严重期有一定的回落;心衰大鼠BNP表达水平随心衰发生的严重程度逐渐升高。3.心衰发生后心肌细胞损伤,长杆状细胞减少。4.发生心衰的心肌细胞观测到的钙火花与正常的钙火花相比,幅度大小降低、达峰时间及持续时间明显延长,提示心肌细胞整个钙循环功能受阻,包括钙激发与钙回摄。5.钙循环是心肌细胞保证收缩舒张功能的基础,心衰发生过程中,钙释放部位与兴奋收缩耦联相关的JP-2蛋白与及肌浆网钙回摄的SERCA2a蛋白均表现逐步下降,并且蛋白的变化在时间上与钙火花发生变化时间相符,两者发生变化具有相关性,提示多种机制发生造成心衰。
【学位单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：R544.1;R-332;R541.6
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略词表
第1章 综述
    参考文献
第2章 实验研究
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验动物
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 动物分组
        2.2.2 CHF 模型制备
        2.2.3 大鼠尾动脉压监测
        2.2.4 大鼠 CHF 发生的标志物 BNP 检测
        2.2.5 单个心室肌细胞的获取
        2.2.6 Confocal 下钙信号观察
        2.2.7 获得图像的处理
        2.2.8 Western Blotting
        2.2.9 统计分析
    2.3 实验结果
    2.4 讨论
    2.5 结论
    参考文献
致谢
攻读硕士期间取得的学术成果

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本文编号：2874062