Rab7对臣噬细胞中TLR9活化后产生的Ⅰ型IFN的调控及机制研究

发布时间：2020-11-12 21:01

　　 TLR9是模式识别受体TLR家族中的一员,主要识别含有CpG基序的寡核苷酸CpG ODN,从而启动天然免疫应答。但TLR9的异常或过度活化会导致生理功能紊乱和疾病的发生。Rab7是一类定位于晚期内体／溶酶体结构的小G蛋白,已经有研究表明,Rab7参与到多种信号转导过程。但关于Rab7对TLR9的信号通路的研究却相对较少。目的：研究Rab7对TLR9活化后产生的I型IFN和其它细胞因子以及对MAPK信号通路的影响,并探讨其作用机制。方法：(1)采用siRNA干扰技术,沉默RAW264.7细胞中的Rab7基因,Real timePCR和Western blot检测TLR9 mRNA和蛋白的表达水平变化,Real time PCR检测TNF-α、IL-1β、IL-10、IFN-α、IFN-β、IP-10和iNOS细胞因子mRNA表达水平的变化,Western blot检测TLR9下游信号通路中ERK、JNK、 p38的磷酸化水平变化。(2)将Rab7真核表达质粒(pcDNA3.1/mRab7)、C末端缺失质粒(pcDNA3.1/ Rab7△C)和T22N突变质粒(pcDNA3.1/Rab7T22N)通过脂质体法转染巨噬细胞RAW264.7, G418筛选,建立稳定表达Rab7及其突变体的细胞系。以这些细胞系为模型,Real time PCR和Western blot检测CpG刺激后TLR9 mRNA和蛋白水平变化,及TNF-α、IL-1β、IFN-α、IFN-β细胞因子mRNA表达水平的变化,Western blot检测TLR9下游信号通路中ERK、JNK、p38的磷酸化水平变化。(3)分别对四种细胞系使用ERK、JNK、p38、NF-κB抑制剂PD98059, SP600125, SB203580, PDTC预处理30min, ELISA检测细胞培养上清中IFN-β和IL-10分泌的变化。结果：(1)Rab7基因沉默后TLR9 mRNA和蛋白的表达水平明显降低；Rab7过表达后TLR9 mRNA和蛋白的表达水平显著升高,Rab7突变后TLR9mRNA和蛋白的表达水平显著降低。(2)Rab7基因沉默后TNF-α、IL-1β、IL-10、IFN-α、IFN-β、 IP-10和iNOS mRNA的表达水平显著升高；Rab7过表达后TNF-α、IL-1β、IFN-α、 IFN-β的表达水平显著降低,Rab7突变后TNF-α、IL-1β、IFN-α、IFN-β的表达水平显著升高。(3)Rab7基因沉默后ERK、p38的磷酸化水平明显升高,JNK的磷酸化水平显著降低：Rab7过表达后ERK和p38的磷酸化水平明显下降,Rab7 C端缺失后ERK和p38的磷酸化水平明显升高,Rab7T22N突变后ERK、p38的磷酸化水平无明显变化。(4)Rab7突变后,与DMSO处理的对照组相比,SP60015预处理后CpG刺激不能促进IFN-β的分泌,而抑制剂PD98059, SB203580, PDTC预处理后则没有类似作用；CpG刺激8h后,抑制剂SB203580和PDTC预处理不能促进IL-10的分泌,抑制剂PD98059,SP60015预处理后没有类似作用。结论：(1)Rab7促进TLR9的表达。(2)Rab7以C端依赖的方式抑制TLR9信号转导途径中ERK和p38 MAPK信号通路。(3)Rab7抑制细胞因子TNF-α、IL-1β、 IFN-α和IFN-βmRNA的表达。(4)Rab7通过JNK MAPK途径调节IFN-β的分泌,通过p38 MAPK和NF-κB信号途径来调节IL-10的分泌。
【学位单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：R392
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
1 引言
    1.1 Rab蛋白家族介绍
        1.1.1 Rab循环
        1.1.2 Rab蛋白的膜靶标
        1.1.3 Rab7简介
    1.2 Toll样受体家族介绍
        1.2.1 TLRs简介
        1.2.2 TLR9与配体
        1.2.3 TLR9活化后的信号转导
        1.2.4 TLR9与疾病
    1.3 研究目的与意义
2 Rab7对巨噬细胞中TLR9活化后产生的Ⅰ型IFN的调控及机制研究
    2.1 实验材料
        2.1.1 细胞株及主要试剂
        2.1.2 实验仪器
        2.1.3 主要试剂配制
        2.1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶与浓缩胶的配制
        2.1.5 荧光定量引物序列
    2.2 实验方法
        2.2.1 RAW264.7细胞的培养
        2.2.2 siRNA转染RAW264.7
        2.2.3 质粒转染及稳定表达细胞系的筛选
        2.2.4 细胞总RNA提取
        2.2.5 cDNA的制备
        2.2.6 Real time PCR检测
        2.2.7 细胞蛋白提取及BCA法蛋白含量的测定
        2.2.8 SDS-PAGE电泳
        2.2.9 Western Blot检测
        2.2.10 ELISA试剂盒检测
3 结果分析
    3.1 siRNA干扰后Rab7 mRNA的表达
    3.2 Rab7对TLR9 mRNA和蛋白表达水平的影响
        3.2.1 Rab7基因沉默后对TLR9 mRNA和蛋白表达水平的影响
        3.2.2 Rab7过表达和突变后对TLR9 mRNA和蛋白表达水平的影响
        3.2.3 小结
    3.3 Rab7对TLR9活化后产生的Ⅰ型IFN和其它下游信号因子mRNA表达水平的影响
        3.3.1 Rab7基因沉默后对TLR9活化后产生的Ⅰ型IFN和其它下游信号因子mRNA表达水平的影响
            3.3.1.1 Rab7基因沉默后对CpG刺激的TNF-α、IL-1β、IL-10 mRNA表达的影响
            3.3.1.2 Rab7基因沉默后对CpG刺激的IFN-α、IFN-β mRNA表达的影响
            3.3.1.3 Rab7基因沉默后对CpG刺激的IP-10 mRNA表达的影响
            3.3.1.4 Rab7基因沉默后对CpG刺激的iNOS mRNA表达的影响
        3.3.2 Rab7过表达和突变后对TLR9活化后产生的Ⅰ型IFN和其它下游信号因子mRNA表达水平的影响
            3.3.2.1 Rab7过表达和突变后对TNF-α和IL-1β mRNA表达的影响
            3.3.2.2 Rab7过表达和突变后对IFN-α和IFN-β mRNA表达的影响
        3.3.3 小结
    3.4 Rab7对TLR9下游MAPK信号通路的影响
        3.4.1 Rab7基因沉默后对TLR9下游MAPK信号通路的影响
        3.4.2 Rab7基因过表达和突变后对TLR9下游MAPK信号通路的影响
        3.4.3 小结
    3.5 ERK、JNK、p38、NF-κB抑制剂预处理后,Rab7过表达及突变后细胞培养上清中IFN-β和IL-10分泌的变化
4 讨论
5 结论
6 展望
致谢
参考文献
作者简介

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本文编号：2881235