鼻疽诺卡菌哺乳动物细胞侵袭蛋白生物信息分析及克隆表达与侵袭性研究

发布时间：2017-04-06 05:04

  本文关键词：鼻疽诺卡菌哺乳动物细胞侵袭蛋白生物信息分析及克隆表达与侵袭性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的了解mce基因及蛋白质序列的特征,并对其同源性进行分析,构建系统进化发育树,对鼻疽诺卡菌mce1操纵子6个mce蛋白的二级结构及其B细胞抗原表位进行预测;从鼻疽诺卡菌IFM10152基因组中扩增6个mce基因(mce1A-mce1F),构建6个mce基因的表达载体;诱导表达鼻疽诺卡菌mce1操纵子中的6个mce蛋白,并将诱导成功的蛋白进行纯化;将纯化后的蛋白进行复性,并进行侵袭功能的鉴定。方法从NCBI数据库中获取mce基因及氨基酸序列,利用生物信息软件Lasergene和MEGA对其进行分析并构建进化树;综合BepiPred法、可塑性方案、抗原性方案、表面可及性方案、亲水性方案以及二级结构对6个mce蛋白进行B细胞抗原表位预测;采用PCR技术扩增6个mce基因,利用基因重组技术构建表达载体;利用IPTG进行诱导表达,超声裂解后利用SDS-PAGE鉴定其表达形式,将获得的蛋白利用His Bind蛋白纯化试剂盒进行纯化,并通过透析法对纯化后的蛋白进行复性;利用乳胶微粒包被复性后的蛋白,与HeLa细胞共同培养,收集细胞后,利用透射电子显微镜观察侵袭结果。结果(1)鼻疽诺卡菌mce1操纵子6个mce基因之间的相似性为40.1%~54.6%,不同菌之间mce蛋白具有一定的同源性;(2)鼻疽诺卡菌mce1操纵子6个mce蛋白均含有一个跨膜结构,二级结构以不规则卷曲为主,mce1A、mce1D、mce1E蛋白均含有6个B细胞抗原表位mce1B蛋白含有7个B细胞抗原表位,mce1C蛋白含有2个B细胞抗原表位,mce1F蛋白含有10个B细胞抗原表位,且大多位于蛋白质C-端;(3)成功扩增了6个mce基因,并构建了重组质粒pET30a-mce1A、pET30a-mce1B、pET30a-mce1C、pET30a-mce1D、pET30a-mce1E、pET30a-mce1F,成功诱导表达了mce1A、mce1C、mce1D、mce1E蛋白,其中mce1A、mce1C蛋白的表达量较低,mce1D、mce1E则获得了大量的表达,各蛋白均以包涵体的形式存在;(4)成功纯化了mce1A、mce1D、mce1E蛋白,并对mce1D、mce1E蛋白进行了复性;(5)经乳胶微粒包被后的mce1D、mce1E蛋白侵袭HeLa细胞,结果发现二者均能进入到HeLa细胞内。结论鼻疽诺卡菌mce1操纵子不同mce蛋白之间及不同菌的mce蛋白之间具有一定的同源性;鼻疽诺卡菌mce蛋白为膜蛋白,大部分结构位于膜外,且具有多个潜在的B细胞抗原表位;鼻疽诺卡菌mce蛋白的诱导表达受基因本身及载体的影响,同时也与IPTG浓度及诱导时间有关;获得了纯化后的蛋白,进行复性后验证了mce1D、mce1E蛋白具有侵袭功能。
【关键词】：鼻疽诺卡菌 生物信息学 抗原表位 克隆表达 哺乳动物细胞侵袭蛋白
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378;Q811.4
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 前言12-16
• 第二章 鼻疽诺卡菌哺乳动物细胞侵袭蛋白的生物信息分析16-30
• 1 材料与方法16-17
• 1.1 序列16
• 1.2 在线分析的主要网站16
• 1.3 生物信息分析软件16
• 1.4 鼻疽诺卡菌mce基因序列与氨基酸序列的获取及及其分析16
• 1.5 鼻疽诺卡菌mce(1A-1F)蛋白二级结构的预测16
• 1.6 鼻疽诺卡菌mce(1A-1F)蛋白抗原表位预测16-17
• 2 结果17-27
• 2.1 鼻疽诺卡菌mce1操纵子各mce基因序列的同源性分析结果17-18
• 2.2 Mce蛋白的系统发育分析18-19
• 2.3 鼻疽诺卡菌mce1操纵子6个mce蛋白的跨膜结构预测结果19-21
• 2.4 鼻疽诺卡菌mce1操纵子6个mce蛋白的二级结构预测21-22
• 2.5 鼻疽诺卡菌mce1操纵子各蛋白的抗原表位预测22-27
• 3 讨论27-30
• 第三章 鼻疽诺卡菌mce1操纵子哺乳动物细胞侵袭蛋白的克隆表达及纯化30-54
• 1 实验材料和方法30-43
• 1.1 材料和试剂30-33
• 1.2 主要溶液及培养基的配制33-36
• 1.3 实验方法36-43
• 2 结果43-50
• 2.1 mce基因PCR扩增43
• 2.2 重组质粒的鉴定43-44
• 2.3 mce重组蛋白诱导结果44-47
• 2.4 鼻疽诺卡菌mce1操纵子mce重组蛋白表达形式的鉴定及纯化结果47-49
• 2.5 重组蛋白mce1D、mce1E的复性49
• 2.6 重组蛋白浓度的测定49-50
• 3 讨论50-54
• 第四章 鼻疽诺卡菌哺乳动物细胞侵袭蛋白mce1D及mce1E侵袭功能的研究54-60
• 1 材料与方法54-57
• 1.1 材料与试剂54
• 1.2 主要溶液的配制54-55
• 1.3 实验方法55-57
• 2 结果57-58
• 3 讨论58-60
• 第五章 结论与展望60-61
• 参考文献61-65
• 综述 哺乳动物侵袭蛋白研究进展65-73
• 参考文献69-73
• 附录73-79
• 作者攻读硕士学位期间发表的论文79-80
• 中英文缩略对照表80-81
• 致谢81

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本文编号：288284