小鼠胚胎干细胞的分离、鉴定和神经定向诱导分化

发布时间：2020-11-14 02:06

　　 胚胎干细胞是从哺乳类动物的囊胚内细胞群或原始生殖嵴细胞分离、 体外培养（抑制其分化）获得的具有发育全能性的细胞。ES细胞是研究哺 乳动物胚胎早期发生、细胞分化、基因调控等发育生物学基本问题的理想 模型，也是组织工程、药理学和临床医学研究的重要工具。昆明小鼠是我 国最常用的实验小鼠。建立昆明小鼠的ES细胞系有利于其转基因动物的 获得，能够为我国的科研工作更好的服务。胚胎干细胞神经定向分化能够 有效地修复中枢神经系统的损伤。由此可见，分离昆明小鼠的胚胎干细胞， 掌握其生物学特性，并了解胚胎干细胞神经定向分化机制是完全有必要的。 本实验利用小鼠胚胎成纤维细胞为饲养层，收集昆明小鼠孕3.5d的囊 胚进行培养，采用二次亚克隆法筛选纯化ES细胞集落，使其稳定传代后对 其生物学性状进行初步鉴定；4-/4+法利用维甲酸、雌激素及它们联合诱导 MESPU35胚胎干细胞系体外分化，免疫细胞化学、免疫荧光双标和流式细 胞仪对分化细胞进行分析，研究上述诱导剂对MESPU35细胞系神经定向 分化的诱导作用，为进一步进行移植学实践打下基础。 结果： 1．培养了95个昆明小鼠囊胚，13例内细胞群离散后出现了胚胎干细 胞样集落，这些集落经过两次亚克隆纯化后，获得两个昆明小鼠胚胎干细胞 株，即KMMES1和KMMES2。 2．KMMES1和KMMES2细胞株具有典型的胚胎干细胞形态，AKP 染色强阳性和全能性；然而两个细胞株生长速度、体外分化能力和正常核 型比例等生物学性状存在一定的差异。 3．相差显微镜观察RA诱导MESPU35细胞系形成神经样细胞拟胚体 百分率随分化时相点和RA浓度升高而升高，与对照组相差显著；雌激素 诱导组与对照组无显著差别：RA联合雌激素诱导组与对照组差别显著， 然而和RA诱导组差别不显著。 4．免疫细胞化学观察RA诱导MESPU35细胞系分化形成的NF200阳 性细胞和 GFAP阳性细胞数随分化时相点和 RA浓度升高而升高；NF200 阳性细胞形态由无突起变为多极细胞，GFAP阳性细胞突起由短变长，最 后联结成网状；分化过程中未见Gale染色阳性细胞出现。 5．免疫细胞化学观察RA联合雌激素诱导MESPU35细胞系分化形成 的NF200阳性细胞和GFAP阳性细胞数随分化时相点和RA浓度升高而升 高；NF200阳性细胞形态多为双极细胞，GFAP阳性细胞形成的突起细长， 两者与 RA诱导组比较细胞体积较小；分化过程中未见 GalC染色阳性细胞 出现。 6．流式细胞仪检测RA诱导MESPU35细胞系分化形成的NF200阳性 细胞和 GFAP阳性细胞的比例，GFAP阳性细胞和 NF200阳性细胞数随分 化时相点和 RA浓度升高而升高，与自然分化 14天的细胞比较相差显著。 结论： 1．我们成功分离了昆明小鼠 ES细胞株，KMME SI和 KMMESZ，通过 观察昆明小鼠ES细胞的生物学性状，为转基因动物的建立打下基础。 2．RA是有效的ES细胞神经定向分化诱导剂，对MESPU35细胞系神 经定向分化的调节以浓度和时间依赖模式进行。ES细胞神经定向分化是研 究神经细胞发育的体外模型。 3．雌激素联合RA诱导后产生的细胞在形态学上有一定变化，提示可 能雌激素激活某些调控神经分化的基因表达，改变神经细胞发育的一般过 程。 4．Gal．c染色始终无阳性细胞出现，此结果可能提示MESPU35细胞 系缺乏生成少突胶质细胞的能力，也可能由于Gal－c是成熟少突胶质细胞 的标志物，而诱导分化时间还不够长。
【学位单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2001
【中图分类】：R329.2
【文章目录】：
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论文正文 小鼠胚胎干细胞的分离、鉴定和神经定向诱导分化
    前 言
    第一部分 昆明种系小鼠胚胎干细胞的分离、培养及特性鉴定
    第二部分 胚胎干细胞神经定向诱导分化实验
参考文献
致 谢
照 片
文献综述
    参考文献

【引证文献】

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1 洪俊君;小鼠ES细胞饲养层制备与ES细胞EGFP瞬时转染效率的研究[D];南京农业大学;2007年

本文编号：2882934