HBRP的表达、纯化与生物学活性分析

发布时间：2020-11-14 21:42

　　 前言 BSP蛋白是由精囊分泌的大量存在于牛精浆中的一个蛋白家族，其成员包括：BSP-A1，BSP-A2，BSP-A3，和BSP-30kDa四种蛋白质。最初是由于可以促进培养中的大鼠垂体前叶细胞分泌促性腺激素而被分离、纯化的。但许多学者都认为此作用所需浓度太高(10~(-6)M)，因而应无重要的生理意义。BSP-A1／A2和A3的N-端都是天冬氨酸，C-端为半胱氨酸，并都含有两对二硫键，由此形成了两个基本相同的疏水结构区。在每个疏水区中半胱氨酸残基是按1—3和2—4顺序形成二硫键，这样构成的胱氨酸多肽环被称作Ⅱ型结构，目前认为Ⅱ型结构是BSP蛋白多种功能的结构基础。 BSP蛋白是具有多种结合功能。Manjunath曾证明BSP蛋白可通过射精粘附于精子表面，并证明BSP蛋白与精子的结合位点是精子胞膜上的磷脂类。BSP蛋白还可与胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)、载脂蛋白A-I(apoA-I)、纤维蛋白原、肝素、钙调蛋白等结合。BSP蛋白与精子的获能及顶体反应有密切关系。BSP蛋白还可促进精子胞膜上的胆固醇外流，目前已有报导认为精子胞膜上高浓度的胆固醇是妨碍获能的一个重要原因。这些都暗示了BSP在精子胞膜的脂类代谢及调节精子的获能及顶体反应方面均发挥着重要作用。 目前在猪及马的精浆中也都发现了与BSP蛋白同源的蛋白质的存在。这些都说明BSP蛋白及其同源蛋白在哺乳动物中是广泛存在的，并应当具有一定的生理意义。而在我们的实验中为了发现和研究BSP及其相关蛋白在受精卵的发育中的重要作用， 寻找 BSP相关的新基因，克隆了一个与 BSP蛋白相关基因的山一 NA序列并将该基因编码的蛋白质在原核细胞中进行了表达和纯 化，将纯化后的融合蛋白作了一些生物学功能方面的初步工作，发 现新蛋白对TPK有一定的抑制作用，而TPK是细胞生长和代谢中 十分重要的关键酶，这对于进一步研究新蛋白的生物学功能具有 十分重要的意义。 材料与方法 本实验首先对转化后的大肠杆菌 BIZI进行小规模培养，通 过碱裂解法提取质粒DNA，然后用限制性内切酶BamH和Xho 双酶切 37 T过夜，酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定质粒 DNA 的完整性与变异性。然后依据鉴定结果挑取阳性单菌落在LB培 养基中大规模扩增培养，将收集的菌体进行超声裂解离心后，分别 收集上清和沉淀，对沉淀中大量存在的包涵体进行变性、洗涤、纯 化和溶解，最后复性等多步处理，最后得到大量的表达的GST融 合蛋白，再经过凝血因子 Xa酶切和 Gitathione－seph。sc 4B亲 和层析纯化后，得到纯度较高的重组蛋白HBRP。实验中各步纯 化和处理结果通过 10％SDS－PAGE来监测目的蛋白去向，对于 最后得到的GST融合蛋白可通过抗GST抗体进行免疫印迹杂交 来检测。 我们从大鼠子宫中通过DEAE－52离子交换柱等纯化得到 TPK样品，收集有活性部分，一切操作在4t中进行，然后观察通 过基因工程得到的HBRP对TPK活性的影响。用Becklnan液闪 仪测定cPm值。蛋白定量采用酚试剂法，以牛血清白蛋白为标准 蛋白。 ·二· 结 果 融合基因的正确性通过得到的表达质粒的酶切和琼脂糖电泳 显示在预定位置 850hP和 5 e分别显示了两条带。同预想结果基 本吻合，大规模培养后纯化得到的融合蛋白通过SDS－PAGE显 示在52KDa处有一条带，而酶切后产物电泳结果显示在26KDa处 分另有两条蛋白带，其中一条为GST，另一条为HBRP，基本符合 实验结果；HBRP对TPK活性的抑制呈剂量依赖性。当 HBRP10g时可抑制其68％的活性。当Li TPK活性下降的百分 数显示重组蛋白HBny的抑制作用时，TPK活性（百分数）的对数 与HBny的用量间存在线性关系。 讨 论 BSP蛋白是牛精浆中大量存在的一个蛋白家族，包括BSP－ AI／AZ、BSP—A3、BSP—30KDa四种蛋白。已有各种证据显示 BSP蛋白参与了精子的获能过程甚至顶体反应，获能及顶体反应 是受精过程的重要环节。本实验通过基因重组技术获得了大量的 表达蛋白，同时也初步探索了该表达蛋白的一些生物学活性作了 有益的尝试。 通过大肠杆菌E．COlt BLZI生产融合蛋白，重组后的 DNA序 列包括一个PGEX质粒，依照PGEX质粒的融合蛋白的表达是在 tao启动子的控制之下，而枯 启动子可由乳糖的类似物I刚来 诱导它表达。PGEX载体携带有lac’基因，根据文献报导，在此 条件下的质粒的繁殖和融合蛋白的表达对宿主细胞无特异性要 求，但经典实验多采用E．COliBLZI作为宿主细胞。 原核表达系统具有表达效率高，操作方便等特点，但缺乏翻译 ·3· 后修饰，以PGEX载体表达的GST－HBRP融合蛋白，具有表达的 蛋白稳定性好，在体外易于纯化等优点，表达的GST融合蛋白可 用 Gluthione Seph删sc 4 B进一步纯化一Factor Xa酶切与测分 离，从而大量获得HBRP重组蛋白，而且一次回收率大约在90％ 以上。在温和的非变性条件下可保持蛋白的抗原性和生物学功 能，在此基础
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2002
【中图分类】：Q51
【文章目录】：
一、 中文摘要
二、 英文摘要
三、 英文缩略语
四、 前言
五、 实验材料
六、 实验方法
七、 实验结果
八、 讨论
九、 结论
十、 论文图片
十一、 参考文献
十二、 致谢
十三、 个人简介

【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 黄蓬,缪时英,王琳芳;一种抑制pGEX载体系统本底表达的方法[J];生物化学与生物物理进展;1998年01期

2 刘新光,梁念慈,马涧泉;重组人蛋白激酶CK 2α亚基的原核表达、纯化与鉴定[J];中国生物化学与分子生物学报;2000年01期

3 罗阳,张学,刘莹,姜莉,刘兴元,于秉治;人牛精浆蛋白相关新基因的cDNA克隆、定位和表达[J];中国生物化学与分子生物学报;2002年02期

本文编号：2883983