内源性血管生成抑制剂—Kringle5蛋白在毕赤酵母菌中分泌表达及其哺乳动物细胞分泌表达质粒的构建

发布时间：2020-11-18 12:22

　　 目的：Kringle5(简称K5)蛋白在毕赤酵母中高效分泌表达、纯化及其质量评价方法研究，以及K5蛋白哺乳动物细胞分泌表达质粒的构建。 方法：首先，用电转化的方法将p819-8αK5质粒转入毕赤酵母菌GS115感受态，通过不同浓度(2mg／ml、4mg／ml和8mg／ml)的G418—YPD平板结合表达量的筛选方法筛选出高效分泌表达K5蛋白的毕赤酵母菌。建立由DEAE离子交换层析和S—100分子筛层析为主体的纯化工艺流程。对纯化的蛋白进行质量评价试验，包括蛋白质的一般性质测定，如分子量、纯度、等电点、含量等以及生物学活性方面的测定，细胞水平：内皮细胞增殖抑制试验、内皮细胞迁移抑制试验；组织水平：鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制试验；整体水平：移植瘤生长抑制试验。其次，通过两步PCR方法按照人的密码子偏爱性合成K5蛋白的DNA序列，克隆至哺乳动物细胞表达载体pDV，并对其生物学活性进行初步研究。 结果：得到了一批具有高效分泌表达K5蛋白能力的毕赤酵母菌株，在诱导茵液上清中，K5蛋白含量在200mg／L以上。初步建立了纯化工艺流程，经纯化后的蛋白纯度在95％以上。测定了K5蛋白的一些理化指标，表观分子量在15％SDS—PAGE胶中表现为17.5KD左右；在等电聚焦电泳中其等电点表现为pH5.2左右。探讨了K5蛋白生物学活性测定方法，细胞水平：在内皮细胞增殖抑制试验中，K5蛋白表现出对内皮细胞增殖有抑制作用；在内皮细胞迁移抑制试验中，表现出对内皮细胞迁移的抑制作用；组织水平：在鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制试验中，表现出对鸡胚绒毛尿囊膜上的微小血管的生成和发育干扰作用；整体水平：在H22鼠源移植瘤生长抑制试
【学位单位】：中国药品生物制品检定所
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R346
【部分图文】：

图1.2p819一8aKS表达载体的酶切MZ:DL2000;1:hIol(1851bp+p+1241bp+1321bp+1837bp+2555bp+33bp+2458bp+7077bp);4:ECo脚(5078bp+4bp+1277bp+8961bp);6:石叮刀dlll(1851b知，各条带与理论值一致，说明p819一8o

中国药品生物制品检定所硕士学位论文实验结果载体鉴定的示意图体p819是胞内表达载体pA08巧和分泌表达，p819一8aKS含有八个拷贝的K5蛋白分泌方I之间.

图1.3转化菌株的筛选:MD平板;B:Zmg/mlG418一YpD平C:4mg/mlG418一YPD平板;D:smgm/1G418一万PD平转化的方法，在MD平板上得到200~300多个转化子，G418一YPD平板上仍能生长，将这7个转化子分别命名70℃、2既甘油一YDP培养基中保存，并进一步在摇瓶水物t’的鉴定结果到的7个转化子在姗平板上都能正常生长形成菌落，7个转化子都在酵母菌基因组上的Aoxl基因处发生插筛选结果.4可以看出，Y1和Y4表达量很低，几乎没有K5蛋白，均在0.3mgm/1以上，纯度分别为为70.4%、81.3%之，但表达量也在0.mZgm/l以上，因此我们选取Y5
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本文编号：2888713