ICOS信号通路阻断分子ICOSIg的制备及其结构功能分析

发布时间：2020-11-21 10:48

　　 抗原特异性T淋巴细胞免疫应答的有效产生及维持需要两种信号――MHC-肽复合物提供的特异性抗原信号，以及由APC表面共刺激分子提供的共刺激信号(Costimulatory signal)，缺乏共刺激信号的抗原信号往往引起免疫耐受。CD28/CTLA-4－B7.1/B7.2共刺激途径是最早深入研究的共刺激途径之一，来自该途径的共刺激信号对T细胞的活化和耐受发挥着重要调节作用。但众多证据表明CD28并不是唯一的共刺激分子，例如CD28缺失的小鼠仍能产生一定的免疫应答[1-4]。同时也有研究表明： T细胞免疫应答后期，来自CD28的共刺激信号对活化后的T细胞发挥效应并非必不可少，甚至不能称为主要的信号[5-7]。 随着基因组计划的完成，多种具有共刺激效应的T细胞表面受体被发现，有关T细胞活化共刺激信号的研究取得了许多新进展。这些研究成果明确了B7-1/B7-2—CD28/CTLA-4和 CD40L-CD40共刺激信号通路在激发初始T细胞活化中占主导地位，同时也发现，大部分效应性CD8+和CD4+T细胞的功能的发挥和维持，以及记忆性T细胞发生再次应答并不依赖这两条共刺激信号通路，提示在T细胞应答的不同时空阶段，不同的共刺激信号对T细胞的功能和效应发挥着各自不同的调节作用[6.7]。在初始T细胞的活化阶段，CD28、CD40L的共刺激信号发挥重要作用，而在记忆和效应T细胞的功能发挥和维持阶段可能还存在其他的免疫分子的参与[8,9]。 最近，ICOS-B7RP-1信号通路在参与调节记忆性和效应性T细胞功能、维持外周耐受等方面的功能引起我们极大的关注。ICOS(Inducible COStimulator，诱导共刺激分子)是CD28家族中继发现CD28、CTLA-4之后的第3个成员。ICOS需要TCR信号的诱导，局限表达于活化后的T细胞膜上，故命名为诱导共刺激分子[10,11]。其配体ICOSL(B7RP-1，B7H2)是B7家族成员，主要在B细胞和单核细胞表达[12]。目前认为ICOS作用于免疫应答的效应和记忆阶段，对已经受到抗原刺激的免疫细胞扩增、迁移释放效应性细胞因子都具有重要的影响[13,14]。此外，ICOS途径还能上调T细胞表面多种趋化因子受体的表达，并且能促进CD40L的表达，间接增强CD40-CD40L途径的免疫活化效应[15-17]。这些发现提示，效应T细胞和记忆T细胞的功能发挥和维持依赖于ICOS的共刺激信号。此外，多种疾病的动物模型研究表明，以ICOS途径为靶点的免疫调节对自身免疫性疾病和移植免疫的长期耐受形成均有着重要的临床治疗 WP=11 意义[18,19]。 由于ICOS诱导表达于活化后T细胞上，并且在效应性和记忆性T细胞功能的发挥和维持上起着重要作用，因此，干预ICOS共刺激途径，可能有助于调节主要由活化后T细胞介导的免疫应答，如移植免疫中慢性排斥反应、I型糖尿病等。基于上述考虑，我们试图通过单独阻断ICOS共刺激途径或联合干预其他相关途径来研究ICOS对活化后的T细胞介导的免疫应答的抑制作用，在本研究中，围绕制备ICOS共刺激信号的阻断剂――可溶性融合蛋白分子ICOSIg，主要进行了以下几部分的工作： 1. 人ICOSIg真核表达载体的构建 ⑴人ICOS全长cDNA的克隆及其真核表达载体的构建：采用PCR技术，从cDNA文库phAD.CAD扩增出人ICOS全长的cDNA序列，定向克隆入真核表达载体pCI-neo中，酶切测序鉴定，为从细胞水平研究ICOS的功能奠定了基础。 ⑵人ICOSIg真核表达载体的构建：利用基因工程技术将ICOS膜外区与hIgG1Fc一起装入真核表达载体pcDNA3中，酶切测序鉴定，证实得到了ICOS的可溶性表达重组载体。 2. 人ICOSIg融合蛋白的表达，纯化和鉴定。 ⑴脂质体法转染COS-7；夹心ELISA法证实培养上清中有融合蛋白的表达。 ⑵蛋白A亲和层析法纯化融合蛋白ICOSIg，用SDS-PAGE、夹心ELISA、Western Blot鉴定融合蛋白的表达。 ⑶利用混合淋巴细胞反应证实ICOSIg在体外具有抑制T细胞增殖、降低IL-10分泌功能，表明ICOSIg具有阻断ICOS途径的生物活性。为进一步的功能研究或应用打下基础。 3. ICOSIg的蛋白质分子特性和结构功能关系的生物信息学分析 ⑴利用生物信息学手段预测CD28家族各成员膜外区和IgV结构域序列，分析ICOSIg的蛋白质分子特性。 ⑵在此基础上，通过同源模建手段，获得了ICOS和ICOSIg的三维空间结构，发现FDPPPF和TKGSGN基序可能是ICOSIg的功能位点，后者未见报道。为改造ICOS的结构功能，获得新的ICOS突变体提供线索。
【学位单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2003
【中图分类】：R392
【部分图文】：

体积 99μl↓℃ 2min，暂停，加入 Taq DNA 聚合酶 1μl( 5U)↓Touchdown PCR℃ 30sec，65℃→50℃ 30sec，72℃ l min； 15 个循环，每个循环降 1后退火温度从 65℃降到 50℃。↓ 30sec，55℃ 30sec，72℃ l min； 30 个循环↓ 10min 4μl PCR 产物于 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。、人 ICOS 真核表达载体的构建构建策略

第三军医大学硕士学位论文筛选、鉴定板上的若干单个菌落，接种于 5m200rpm 振摇培养过夜，以 OmegaⅠ、SalⅠ酶切鉴定，初步判定阳性接，系定向克隆，无需鉴定阳性重实验结果DNA 的 PCR 扩增产物电泳鉴定：期相符，特异性高，未见明显的引1 2 3

图 1-2 人 ICOS-pCI-neo 的酶切鉴定fication of recombinated hICOS-pCI-neo plaCI-neo 的序列测定结果( 见图 1-P-036224)比对，开放阅读框完整公布序列相同。表明我们已经将人载体上，为下一步工作打下基础
【共引文献】

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本文编号：2892897