人肝细胞可回复永生化逆转录病毒载体的初步研究
发布时间：2020-12-05 06:37
背景和目的:肝细胞材料已成为限制生物人工肝（bioartificial liver, BAL）及肝细胞移植（hepatocytes transplantation, HTX）发展的瓶颈问题,这一问题的解决必将大大提升BAL及HTX的临床实用价值。理论上讲,人肝细胞（包括成人肝细胞及人胎肝细胞）最为理想,但成人供肝来源极其有限且仅用于肝移植,加之成人肝细胞在体外增殖能力差,故大量获得成人肝细胞是不可能的。胎肝的利用因涉及伦理问题,亦难以推广应用。使用动物肝细胞又存在发生免疫反应及传播动物病毒的危险。肝细胞株（如HepG2、C3A、HHY41、HepZ等）分化功能较原代肝细胞差,且多为瘤源性或由原代肝细胞经病毒转染获得,存在安全性问题。可回复性永生化程序为解决细胞材料问题提供了新的思路及手段。其基本原理是先将永生化基因猿猴病毒40大T抗原基因（simian virus 40 large T antigen gene, SV40T）导入原代细胞以获得永生化细胞株,使其获得体外增殖能力,然后再以特异性位点重组技术切除SV40T基因,使细胞株回复到永生化前的状态,这样细胞既得到了增殖又不具有致癌...
【文章来源】：中国人民解放军陆军军医大学重庆市
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
可回复性永生化载体构建新策略
14图 1-1 逆转录病毒载体 pLXSN 及其多克隆位点结构组阳性克隆的鉴定R 法：在 20μl 反应体系中加入无菌水 19.2μl，2×PCR 混合液 10μl，2 引物各 0.4μl 使其终浓度为 1μM，用高压灭菌牙签或无菌吸头沾取入反应体系中。反应条件：94℃预变性 5 分钟；然后 94℃30s，58 30 个循环；最后 72℃延伸 10 分钟。将 PCR 产物加到 1%琼脂糖凝分离出 784bp 条带者为阳性。切法：取 PCR 阳性克隆接种于 5ml 含 100U/ml 氨苄青霉素的 LB 培 250r/分钟振荡培养过夜。碱裂解法提取质粒 DNA，用 BamHⅠ和，1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，以 pLXSN 行相同双酶切作为对照。
第三军医大学硕士学位论文述方法筛选的阳性克隆质粒 DNA 进行测序分析，由上海生成，引物为 pLXSN 产品自带测序引物 P5'。结 果态细胞的转化效率 质粒 pUC18 转化 50μl 感受态细胞，转化原液体积为 250μh 后，长出 1000 多个菌落（图 1-2）。而受体菌对照平板未率约为 108转化体/μg 超螺旋质粒（转化频率=转化体总数
【参考文献】：
期刊论文
[1]The development of a new bioartificial liver and its application in 12 acute liver failure patients[J]. Yi-Tao Ding Yu-Dong Qiu Zhong Chen Qing-Xiang Xu Qing Tang De-Cai Yu Hepatobiliary Surgery Department,affiliated Drum Tower Hospital of Medical College of Nanjing University,Hepatobiliary Institute of Nanjing University;Hepatobiliary Surgery Institute of Nanjing,Jiangsu Province,210008,China He-Yuan Zhang Biochemistry Department in Nanjing University,Jiangsu Province,China. World Journal of Gastroenterology. 2003(04)
[2]应用以菌落为模板的聚合酶链反应技术筛选重组阳性克隆[J]. 生秀杰,周伟强,姜莉,王太一,张学. 中华检验医学杂志. 2002(04)
[3]SV40诱导髁突软骨细胞永生化的实验研究[J]. 段小红,吴军正,毛勇,李峰,杨彤元. 中华口腔医学杂志. 2001(01)
[4]人工肝生物成分的研究进展[J]. 陈耀凯,王宇明. 中华实验外科杂志. 2000(05)
[5]Cultivation of human liver cell lines with microcarriers acting as biological materials of bioartificial liver[J]. GAO Yi; XU Xiao-Ping; HU Huan-Zhang and YANG Ji-Zhen. World Journal of Gastroenterology. 1999(03)
[6]Experimental study of bioartificial liver with cultured human liver cells[J]. WANG Ying Jie, LI Meng Dong, WANG Yu Ming, NIE Qing He and CHEN Guo Zheng. World Journal of Gastroenterology. 1999(02)
本文编号：2899048
【文章来源】：中国人民解放军陆军军医大学重庆市
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
可回复性永生化载体构建新策略
14图 1-1 逆转录病毒载体 pLXSN 及其多克隆位点结构组阳性克隆的鉴定R 法：在 20μl 反应体系中加入无菌水 19.2μl，2×PCR 混合液 10μl，2 引物各 0.4μl 使其终浓度为 1μM，用高压灭菌牙签或无菌吸头沾取入反应体系中。反应条件：94℃预变性 5 分钟；然后 94℃30s，58 30 个循环；最后 72℃延伸 10 分钟。将 PCR 产物加到 1%琼脂糖凝分离出 784bp 条带者为阳性。切法：取 PCR 阳性克隆接种于 5ml 含 100U/ml 氨苄青霉素的 LB 培 250r/分钟振荡培养过夜。碱裂解法提取质粒 DNA，用 BamHⅠ和，1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，以 pLXSN 行相同双酶切作为对照。
第三军医大学硕士学位论文述方法筛选的阳性克隆质粒 DNA 进行测序分析，由上海生成，引物为 pLXSN 产品自带测序引物 P5'。结 果态细胞的转化效率 质粒 pUC18 转化 50μl 感受态细胞，转化原液体积为 250μh 后，长出 1000 多个菌落（图 1-2）。而受体菌对照平板未率约为 108转化体/μg 超螺旋质粒（转化频率=转化体总数
【参考文献】：
期刊论文
[1]The development of a new bioartificial liver and its application in 12 acute liver failure patients[J]. Yi-Tao Ding Yu-Dong Qiu Zhong Chen Qing-Xiang Xu Qing Tang De-Cai Yu Hepatobiliary Surgery Department,affiliated Drum Tower Hospital of Medical College of Nanjing University,Hepatobiliary Institute of Nanjing University;Hepatobiliary Surgery Institute of Nanjing,Jiangsu Province,210008,China He-Yuan Zhang Biochemistry Department in Nanjing University,Jiangsu Province,China. World Journal of Gastroenterology. 2003(04)
[2]应用以菌落为模板的聚合酶链反应技术筛选重组阳性克隆[J]. 生秀杰,周伟强,姜莉,王太一,张学. 中华检验医学杂志. 2002(04)
[3]SV40诱导髁突软骨细胞永生化的实验研究[J]. 段小红,吴军正,毛勇,李峰,杨彤元. 中华口腔医学杂志. 2001(01)
[4]人工肝生物成分的研究进展[J]. 陈耀凯,王宇明. 中华实验外科杂志. 2000(05)
[5]Cultivation of human liver cell lines with microcarriers acting as biological materials of bioartificial liver[J]. GAO Yi; XU Xiao-Ping; HU Huan-Zhang and YANG Ji-Zhen. World Journal of Gastroenterology. 1999(03)
[6]Experimental study of bioartificial liver with cultured human liver cells[J]. WANG Ying Jie, LI Meng Dong, WANG Yu Ming, NIE Qing He and CHEN Guo Zheng. World Journal of Gastroenterology. 1999(02)
本文编号：2899048
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