1.中国株CN54HIV-1Pol P66/P51在大肠杆菌中的表达与纯化 2.鼠IL-12和IL-23作为基因佐剂与H

发布时间：2020-12-07 19:44

　　由人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）感染所引起的艾滋病（Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS）对人类健康构成了严重的威胁，研究一种快速有效的适合国内HIV病毒感染的检测手段，尤为重要。 HIV-1 pol基因主要编码P66，P51。HIV-1逆转录酶（RT）分子由2个亚基组成（5.1×10⁴kd和6.6×10⁴kd），RT是由pol基因编码以一种多蛋白的形式表达，通常在感染细胞中微量存在。在病毒中，HIV-1 RT以两相关多肽p66和p51亚单位二聚体出现，分子比例为1∶1。P51亚单位是p66亚单位C端裂解而来。p66亚单位由两催化活性结构域，聚合酶，RNase H区域组成。在异源二聚体HIV-1 RT中p51仅仅包括聚合酶结构域，不具有催化活性。 由于HIV的高度变异性，HIV pol基因表达产物诱导的广泛交叉的细胞免疫反应对于研制预防和治疗性HIV疫苗都具有十分重要的意义，pol基因成为越来越多的HIV疫苗的重要组分，定量检测Pol抗... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：100 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
Part Ⅰ
    摘要
    Abstract
    前言
    1 HIV简介
    2 HIV-1基因组结构及功能
    3 HIV-1 pol基因编码产物功能及相互作用
    4 HIV-1 pol特异的抗原表位
    5 HIV-1 pol作为抗原在HIV-1检测与治疗中的作用与地位
    6 本研究的内容、目的与意义
    材料与方法
    1 实验材料
        1.1 菌株与质粒
        1.2 工具酶和主要生化试剂
        1.3 试剂盒
        1.4 主要仪器
        1.5 引物和抗体
    2 方法
        2.1 目的基因扩增、克隆及测序
        2.2 表达载体的构建
        2.3 细菌的培养和诱导表达
        2.4 重组蛋白免疫印迹法鉴定
        2.5 包涵体的分离、提纯
        2.6 包涵体的复性
        2.7 包涵体复性后的纯化
    3 结果与分析
        3.1 目的基因扩增
        3.2 表达载体鉴定
        3.3 重组蛋白P66和P51的表达
        3.4 重组蛋白P66和P51的免疫印迹
        3.5 重组蛋白P66和P51的复性与纯化
    4 讨论
    5 小结
    6 参考文献
Part Ⅱ
    摘要
    Abstract
    前言
    1 DNA疫苗的特点
    2 DNA疫苗的免疫机制
    3 免疫佐剂在DNA疫苗中的应用
    4 IL-12与IL-23的研究进展
        4.1 IL-12结构与功能概述与研究进展
        4.2 IL-23结构与功能概述与研究进展
    5 本研究的内容、目的及意义
    材料和方法
    1 材料
        1.1.1 工具酶
        1.1.2 试剂盒
        1.1.3 质粒和菌株
        1.1.4 主要生化试剂
        1.1.5 实验动物
        1.1.6 主要仪器
        1.1.7 常用溶液配方
        1.1.8 引物
    2 方法
        1.2.1 mIL-12和mIL-23 cDNA的扩增
            1.2.1.1 p40、p35、p19 mRNA逆转录
            1.2.1.2 Nest-PCR法扩增目的基因p40，p35，p19的cDNA
        1.2.2 mIL-12和mIL-23的TA克隆与测序
        1.2.3 mIL-12和mIL-23单亚基真核表达载体的构建
        1.2.4 mIL-12和mIL-23双亚基真核表达载体的构建
        1.2.5 p40、p35、p19基因终止突变及突变克隆的构建
            1.2.5.1 p40、p35、p19基因终止突变
            1.2.5.2 突变克隆的构建
        1.2.6 mIL-12和mIL-23在2937细胞中的表达
            1.2.6.1 细胞培养
            1.2.6.2 质粒转染
            1.2.6.3 Western blot测IL-12和IL-23在293T细胞中的表达
        1.2.7 免疫质粒的大量提取
        1.2.8 动物实验
            1.2.8.1 动物实验分组
            1.2.8.2 动物免疫方案
        1.2.9 免疫指标检测
            1.2.9.1 小鼠的处理（小鼠脾淋巴细胞的制备）
            1.2.9.2 流式细胞仪测IFN-γ胞内分泌
                1.2.9.2.1 细胞处理
                1.2.9.2.2 细胞染色
            1.2.9.3 ELISPOT测IFN-γ胞内分泌
                1.2.9.3.1 包板
                1.2.9.3.2 细胞处理
                1.2.9.3.3 转板处理
    3 结果与分析
        3.1 mIL-12和mIL-23 cDNA的扩增
        3.2 mIL-12和mIL-23的TA克隆与测序
        3.3 mIL-12和mIL-23单亚基真核表达载体的构建
        3.4 mIL-12和mIL-23双亚基真核表达载体的构建
        3.5 mIL-12和mIL-23在293T细胞中的表达
    4 讨论
    5 小结
    6 参考文献
致谢
附录
    1 HIV-1 pol p66 sequence
    2 HIV-1 pol p51 sequence
    3 mIL-12 p40 sequence
    4 mIL-12 p40 mut sequence
    5 mIL-12 p35 sequence
    6 mIL-12 p35 mut sequence
    7 mIL-23 p19 sequence
    8 mIL-23 p19 mut sequence
    9 pDRSV1.0 sequence
    10 pDRSV40 sequence
    11 pDRSV40 mut sequence
    12 pDRSV35 sequence
    13 pDRSV19 sequence
    14 pDRSV19 mut sequence
    15 pDRSV3540 sequence
    16 pDRSV1940 sequence
+40^- sequence">    17 pDRSV19⁺40^- sequence
-40⁺ sequence">    18 pDRSV19^-40⁺ sequence
-40^- sequence">    19 pDRSV19^-40^- sequence
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本文编号：2903802