E型肉毒神经毒素重组Hc-C亚单位疫苗免疫原性研究

发布时间：2020-12-10 00:33

　　目的利用大肠杆菌高效表达并纯化E型肉毒神经毒素（BoNT/E）受体结合区Hc的亚结构域EHc-C蛋白,并进行免疫原性研究。方法利用PCR技术扩增出EHc-C基因,克隆于载体pTIG-Trx-His-tag中得到重组质粒pTIG-Trx-EHc-C,转入表达菌株BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后,超声破碎菌体,收集上清,经镍柱亲和纯化获得重组抗原EHc-C蛋白,通过SDS-PAGE和Western印迹检测纯化效果,之后免疫BALB/c小鼠,评价其免疫原性。结果通过原核表达纯化获得了纯度>90%的重组抗原EHc-C蛋白,该重组抗原作为亚单位疫苗免疫小鼠产生了特异性抗体反应,10μg剂量抗原蛋白3次免疫小鼠即可抵抗104LD50E型肉毒毒素攻击,血清中和抗体效价可达1.00 U/ml。结论获得的重组EHc-C抗原免疫原性良好,免疫小鼠后能抵抗E型肉毒毒素的攻击,产生强烈保护作用,可作为亚单位候选疫苗预防E型肉毒毒素中毒或用于研究肉毒毒素疫苗和抗体的功能表位。 

【文章来源】：军事医学. 2019年05期 第346-351页 北大核心

【文章页数】：6 页

【部分图文】：

pTIG-Trx-EHc-C菌落PCR鉴定图

军事医学2019年5月第43卷第5期MilMedSci，Vol43，No5，May，2019柱对重组EHcC蛋白进行纯化，经SDSPAGE检测纯化得到的蛋白符合目的蛋白的理论大小，且咪唑浓度为100mmol/L时纯度达到了电泳级。Western印迹证实该重组EHcC能特异性与抗EHc血清抗体、抗E型毒素的抗体结合，具有E型毒素的抗原性（图3）。图2EHc-C诱导表达的SDS-PAGE检测M.蛋白质相对分子质量标志物；1.未加IPTG诱导对照；2.包涵体；3.诱导表达破菌上清；4.诱导表达全菌图3EHc-C纯化后SDS-PAGE和Western印迹鉴定M.蛋白质相对分子质量标志物；1.诱导表达破菌上清；2.100mmol/L咪唑洗脱的目的蛋白；3.穿过液；4.脱盐蛋白；5，6.Western印迹检测表达纯化产物：5.一抗为抗EHc抗体；6.一抗为抗E型毒素的抗体22.2重组亚单位疫苗免疫小鼠后体液免疫反应的测定采用ELISA方法检测免疫后小鼠血清中的体液免疫反应，第3次免疫后较第2次的抗体水平迅速增强，阴性对照组的抗体水平无变化（图4），表明此重组抗原免疫原性良好；抗体滴度的结果表明，EHcC抗原免疫组第2次免疫抗体滴度的平均值为1∶3200，最高滴度为1∶6400；第3次免疫抗体滴度平均值为1∶307200，最高滴度为1∶409600（图5），相对于第2次免疫的抗体滴度，第3次有明显的增强，该重组抗原作为亚单位疫苗免疫小鼠后产生了特异性抗体反应；此外，还对免疫后小鼠产生的抗体亚型进行了测定，抗原EHcC免疫小鼠后产生的特异性抗体主要为IgG1（图6），即提示此抗原免疫小鼠后产生的抗体反应更倾向于Th2

?2019年5月第43卷第5期MilMedSci，Vol43，No5，May，2019柱对重组EHcC蛋白进行纯化，经SDSPAGE检测纯化得到的蛋白符合目的蛋白的理论大小，且咪唑浓度为100mmol/L时纯度达到了电泳级。Western印迹证实该重组EHcC能特异性与抗EHc血清抗体、抗E型毒素的抗体结合，具有E型毒素的抗原性（图3）。图2EHc-C诱导表达的SDS-PAGE检测M.蛋白质相对分子质量标志物；1.未加IPTG诱导对照；2.包涵体；3.诱导表达破菌上清；4.诱导表达全菌图3EHc-C纯化后SDS-PAGE和Western印迹鉴定M.蛋白质相对分子质量标志物；1.诱导表达破菌上清；2.100mmol/L咪唑洗脱的目的蛋白；3.穿过液；4.脱盐蛋白；5，6.Western印迹检测表达纯化产物：5.一抗为抗EHc抗体；6.一抗为抗E型毒素的抗体22.2重组亚单位疫苗免疫小鼠后体液免疫反应的测定采用ELISA方法检测免疫后小鼠血清中的体液免疫反应，第3次免疫后较第2次的抗体水平迅速增强，阴性对照组的抗体水平无变化（图4），表明此重组抗原免疫原性良好；抗体滴度的结果表明，EHcC抗原免疫组第2次免疫抗体滴度的平均值为1∶3200，最高滴度为1∶6400；第3次免疫抗体滴度平均值为1∶307200，最高滴度为1∶409600（图5），相对于第2次免疫的抗体滴度，第3次有明显的增强，该重组抗原作为亚单位疫苗免疫小鼠后产生了特异性抗体反应；此外，还对免疫后小鼠产生的抗体亚型进行了测定，抗原EHcC免疫小鼠后产生的特异性抗体主要为IgG1（图6），即提示此抗原免疫小鼠后产生的抗体反应更倾向于Th2型免?


本文编号：2907750