FAH基因敲除克隆小型猪的制备及繁育

发布时间：2020-12-18 22:40

　　目的供体的短缺是器官移植所面临的主要问题,制备人源化器官是解决此问题的有效途径之一。缺乏延胡索酸乙酰乙酸水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase, FAH）会引起遗传性酪氨酸血症Ⅰ型（hereditary tyrosinemia typeⅠ, HTⅠ）,致使患者肝细胞凋亡,呈现出肝损伤。对猪（Sus scrofa）进行基因编辑,建立FAH基因敲除巴马小型猪,结合人干细胞将有利于人源化干细胞肝的制备。本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因（α-1, 3-galactosyltransferase,GGTA1）敲除巴马小型猪的基础上,通过CRISPR/Cas9技术制备FAH基因敲除(FAH^+/-、FAH^-/-)小型猪,并分析其健康与繁育状况。方法针对猪FAH基因设计单链导向RNA （single guide RNA, sgRNA）构建pX330表达载体转染巴马小型猪耳成纤维细胞（ear fibroblasts of Bama minipigs, BMEF）并进行敲除效率验证,鉴定后选择阳性细胞作为核供体,通过体细胞核移植... 

【文章来源】：中国比较医学杂志. 2019年05期 北大核心

【文章页数】：9 页

【文章目录】：
1 材料和方法
    1.1 实验材料
        1.1.1 实验动物
        1.1.2 细胞系
        1.1.3 质粒
    1.2 主要试剂与仪器
    1.3 实验方法
        1.3.1 打靶载体构建
        1.3.2 转染
        1.3.3 sgRNA敲除效率检测
        1.3.4 单细胞克隆的获得及鉴定
        1.3.5 FAH基因敲除克隆猪的制备及鉴定
        1.3.6 仔猪血常规及血生化检测
        1.3.7 组织学切片观察
        1.3.8 Western blot检测
        1.3.9 FAH+/-猪繁育能力及统计学分析
    1.4 统计学方法
2 结果
    2.1 打靶载体构建及效率检测
    2.2 单细胞克隆突变类型的鉴定
    2.3 FAH基因敲除猪的制备与鉴定
    2.4 仔猪血液检测
    2.5 组织学切片观察
    2.6 Western blot检测
    2.7 FAH+/-猪繁育能力分析
3 讨论


【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9介导CMAH基因敲除猪创制及繁育分析[J]. 黄林华,李西睿,龙川,石宁宁,冯冲,杜敏杰,朱辉斌,潘登科,孙秀柱.  农业生物技术学报. 2018(06)
[2]CRISPR/Cas9介导的β4GalNT2基因敲除猪制备[J]. 唐雨婷,高景波,龙川,杜敏杰,黄林华,潘登科,杜晓华.  农业生物技术学报. 2017(10)
[3]Highly efficient generation of GGTA1 knockout pigs using a combination of TALEN m RNA and magnetic beads with somatic cell nuclear transfer[J]. FENG Chong,LI Xi-rui,CUI Hui-ting,LONG Chuan,LIU Xia,TIAN Xing-hua,PAN Deng-ke,LUO Yu-zhu.  Journal of Integrative Agriculture. 2016(07)
[4]干细胞移植治疗肝功能衰竭的研究进展及应用前景[J]. 吴贻琛,万志红,辛绍杰.  肝脏. 2015(03)
[5]柠檬百里香叶挥发油成分分析及对肝癌细胞毒性作用[J]. 吴爽,魏凤香,李红枝,刘小广,张建华,刘君星.  中药材. 2013(05)
[6]利用启动子缺陷型打靶载体敲除五指山小型猪GGTA1基因[J]. 郑道山,冯冲,朱彦宾,龙川,冯书堂,潘登科,马文丽.  生物技术通讯. 2011(04)
[7]新型生物人工肝系统治疗急性肝衰竭犬后猪内源性逆转录病毒传播的实验研究[J]. 陈钟,陈瑞新,丁义涛,田鹏鹏,周卉.  南通大学学报(医学版). 2007(03)

硕士论文
[1]人肝源性干细胞在Fah-/-Rag2-/-小鼠中生物学行为的研究[D]. 刘芳遐.第二军医大学 2010



本文编号：2924726