人组氨酰-tRNA合成酶多肽基因的克隆与表达

发布时间：2021-01-07 03:47

　　皮肌炎／多肌炎是一类自身免疫疾病，严重威胁人类健康。抗组氨酰—tRNA合成酶抗体，临床上又称抗Jo-1抗体，是诊断这类疾病的标志性抗体。该类疾病诊断的最佳方法是酶联免疫吸附实验（ELISA），其灵敏度大大高于免疫双扩散（DID）和对流免疫电泳，但该方法前提是必须应用高纯抗原。生化提取的方法很难得到组分单一的纯制品，只能依靠与标准血清或标准图谱的对照来进行鉴别。利用基因重组技术，制备单一性质的重组Jo-1，可以特异、简单、快速、准确地鉴别和诊断皮肌炎／多肌炎，有效地提高临床诊断水平。 本实验从人胎盘中提取总RNA，利用RT-PCR技术获得了编码Jo-1的基因整长序列，选用IMPACT-CN系统中的pTYB11载体，构建了Jo-1基因的克隆与表达载体，并转化大肠杆菌ER2566，经过抗性筛选、分子量大小比较、双酶切鉴定、和PCR鉴定等多种方法验证，筛选出了5个阳性克隆。通过诱导表达，获得了重组的Jo-1融合蛋白，经SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳分析，产物分子量大小正确。Western blotting免疫检验，该融合蛋白能被特异性抗体识别。但表达量不高，而且以包含体的形式存在。 

【文章来源】：河北大学河北省

【文章页数】：46 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

pTYBll表达载体物理图谱

2准斗1尽5图2总RNA无降解(见图2)，可用于RT一PCR扩一增。23000!飞们介〔!人胎盘总RNA电泳图F19.2IsolationoftotalRNAfromhumanPlaeenta3.1.3RT一PCR扩增人Jo一1基因片段以提取的总RNA为模板，用0119(dT)做反向引物，反转录第一条链。为了获得目的片段，采用了嵌套引物，即首先以反转录产物为模板，用第一对引物primerl、11进行PCR扩增，产物长度为16O8bp，2%琼脂糖凝胶电泳检验，扩增产物单一，分子大小准确，结果见图3。主60810不》图3第一对引物RT一PCR扩增产物电泳图1:RT一PCR产物:M:标准分子量(DL一2000)F19.3RT一PCRamPlifieationofJo一lgeneusingfirstPairofPrimers1:RT一PCRp

图4Jo一1基因二次扩增结果1基因片段，长1585bp;4:为第一次扩增.4PCRamPlifieationofJo一dPCR，1585BP;4:Produeto建肠杆菌表达系统载体的选统表达N端为1ntein的融合基酸为丙氨酸(Ala)时，使洗脱，目的蛋白的纯化效率最一个氨基酸为丙氨酸，为了使，


本文编号：2961847