不同固定方法处理小鼠视网膜行免疫荧光染色的效果比较

发布时间：2021-01-12 16:43

　　目的:免疫荧光染色（ImmunofluorescenceStaining, IF）是进行视网膜研究的重要方法之一。为了获得最优的IF结果,我们对视网膜的固定方法进行优化。方法:以小鼠视网膜为观察对象,分别采用浸泡固定方法（Immersion, I）、灌注法（Perfusion, P）以及两者联合（I+P）的方法进行固定,以IF方法对Pax6和Rhodopsin等抗原进行染色,对比各组视网膜组织的IF染色效果。其中,具体分组包括:浸泡固定2小时组（I2）,浸泡固定12小时组（I12）,浸泡固定24小时组（I24）,灌注组（P）,灌注+浸泡后固定2小时组（P+I2）,灌注+浸泡后固定12小时组（P+I12）。结果:从大体结构来看,P+I2组的固定良好率达100%,I12、I24、P+I12组的良好率达83.33%,I2组和P组较低,分别是16.67%和0%。从Pax6的IF染色来看,I12组的染色满意度达100%,P+I2组和P+I12组的满意度为83.33%,I2组、I24组和P组的满意度较低,为16.67%。从Rhodopsin的IF染色结果来看,P+I2组和P+I12组的染色满意度为... 

【文章来源】：现代生物医学进展. 2019,19(11)

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【部分图文】：

种不同后固定方法处理后小鼠视网膜的Hoechst染色结果

现代生物医学进展biomed.cnjournals.comProgressinModernBiomedicineVol.19NO.11JUN.2019GroupsAmount(n)RateofSatisfactoryStainingRateofDissatisfactoryStainingI2Group616.6783.33I12Group61000I24Group616.6783.33PGroup616.6783.33P+I2Group683.3316.67P+I12Group683.3316.67图26种不同后固定方法处理后小鼠视网膜的Pax6免疫荧光染色结果Fig.2IFstainingofPax6onmouseretinaethatwerefixedbysixdifferentmethodsNote:SectionsofallgroupsshowedpositivestainingintheGanglioncelllayer(GCL)andInnernuclearlayer(INL).TheratesofsatisfactorystainingofeachgroupwerelistedinTable2.GCL=ganglioncellslayer;ONL=theOuternuclearlayer;OPL=Outerplexiformlayer;INL=Innernuclearlayer;IPL=Innerplexiformlayer.Thescalebaris100mm.表2六组视网膜Pax6染色情况(%)Table2IFstainingofPax6insectionsfromthesixgroupsNote:datawereanalyzedwithchi-squaretest.x2=316.9,P<0.0001.是：节细胞层(GCL)、内网状层(Innerplexiformlayer,IPL)、内核层(INL)、外网状层(Outerplexiformlayer,OPL)和外核层(ONL)，在外核层的外侧，则依次分布着感受器细胞的内段(innerseg-ment)和外段(outersegment)[23,24]。节细胞层中包含着大量的神经节细胞和少量错置的无长突细胞；内核层则包含水平细胞、双极细胞、无长突细胞这三种中间神经元以及Müller氏胶质细胞；外核层由视杆细胞和视锥细胞两种感光细胞的胞体组成[25,26]。针对神经视网膜的神经元，以往研究也已经积累了丰富的相关抗原标记物的知识[27]。视神经节细胞可以用抗Brn3抗体、抗Pax6抗体来标记；水平细胞可以被抗NF-M抗体识别；双极细胞使用抗PKC-α抗体来染色；无长突细?

阳性的视杆细胞位于视网膜分层的底层，不易通过浸泡渗透的方法进行固定，从而对位于视杆细胞OS外段部分的Rhodopsin抗原不能很好地保存。P+I2组和P+I12组的Rhodopsin染色结果较好，则说明灌注固定的方法能够对深层的外段部分进行很好的固定，可以与浸泡固定互相补充、互相辅助。再次，对视网膜其他抗原进行染色的结果进一步验证了P+I12为最优组织固定方法，可以满足神经视网膜组织中各种细胞的免疫荧光染色。总之，综合大体组织形态、Pax6和Rhodopsin两种IF染色以及其他抗原染色的结果，染色最差的是I2组和P组，染色中图36种不同后固定方法处理后小鼠视网膜的Rhodopsin免疫荧光组织化学染色结果Fig.3IFstainingofRhodopsinonmouseretinaethatwerefixedbysixdifferentmethodsNote:A:SectionnofI2groupshowedveryweakpositivestainingintheoutersegmentpart(OS)andsomenon-specificstaininginotherlayers.B:SectionnofI12groupshowedpositivestaininginOSbutalsosomenon-specificstaininginotherlayers.C:SectionnofI24groupshowedweakstaininginOS.D:SectionnofP+I2groupshowedaconfusedstainingresultsofRhodopsin.E,F:SectionsofP+I2groupandP+I12groupbothshowedsatisfactorypositivestainingspecificallyinOS.GCL=ganglioncellslayer;ONL=theOuternuclearlayer;OPL=Outerplexiformlayer;INL=Innernuclearlayer;IPL=Innerplexiformlayer.OS=outersegments;IS=innersegmentsThescalebaris100μm.表3六组视网膜Rhodopsin染色情况(%)Table3IFstainingofRhodopsininsectionsfromthesixgroupsGroupsAmount(n)RateofSatisfactoryStainingRateofDissatisfactoryStainingI2Group60100I12Group60100I24Group65050PGroup60100P+I2Group683.3316

【参考文献】：
期刊论文
[1]冰冻切片制作及免疫组化的改进[J]. 赵丽微,杨淑艳,方青.  吉林医药学院学报. 2009(01)
[2]视网膜建模的研究进展[J]. 牛希娴,童善保,朱贻盛,邱意弘.  生物医学工程学杂志. 2008(04)



本文编号：2973150