miR-508-5p慢病毒过表达载体构建及对MAPK1/ERK信号通路靶向抑制作用的研究

发布时间：2021-01-22 11:01

　　目的:构建能高效表达成熟miR-508-5p小分子的慢病毒过表达载体,研究其对MAPK1/ERK信号通路靶向调控作用。方法:利用化学合成miR-508-5p茎环结构RNA,并将其克隆入线性化的pSicoR质粒中,经双酶切及测序鉴定;同时构建与miR-508-5p互补靶基因MAPK1的3’非翻译区,将其克隆入线性化的Report载体中。利用脂质体转染试剂将鉴定阳性的pSicoR-miR-508-5p重组质粒转染HEK-293T细胞,进一步通过Relative luciferase activity、Western blot及real-time PCR试验检测MAPK1蛋白和mRNA相对表达水平。结果:酶切及测序结果证明成功构建pSicoR-miR-508-5p及Report-MAPK1 3’-UTR重组质粒,并通过实验证实miR-508-5p过表达明显抑制MAPK1的蛋白表达水平及mRNA相对含量（P<0.05）;抑制miR-508-5p的表达,又明显上调MAPK1的蛋白表达水平及mRNA相对含量（P<0.05）。结论:成功构建pSicoR-miR-508-5p慢病毒过表达载... 

【文章来源】：中国免疫学杂志. 2014,30(01)北大核心

【文章页数】：6 页

【部分图文】：

pSicoＲ-miＲ-508-5p和预测靶基因Ｒeport-MAPK13'-UTＲ双酶切图

图2pSicoＲ-miＲ-508-5p过表达载体测序结果Fig．2SequencingresultsofpSicoＲ-miＲ-508-5poverexpressionvector图3Ｒeport-MAPK13'-UTＲ重组质粒测序结果Fig．3Sequencingresultsofreport-MAPK13'-UTＲplasmid图4双荧光素酶报告系统验证miＲ-508-5p与MAPK1靶向抑制作用，共转染海蜃荧光素酶做内对照Fig．4TovarifythetargetedinhibitionbetweenmiＲ-508-5pandMAPK1withluciferasereportersystem，co-transfectionluciferaseofseamirageasaninternalcontrolNote:*．P＜0．05．2．3双荧光素酶报告系统hsa-miＲ-508-5p过表达载体组明显抑制MAPK1的荧光素酶活性，与正常对照组相比下降约6倍(P＜0．05);而转染了hsa-miＲ-508-5pinhibitor组，MAPK1的荧光素酶活性又明显升高约1．5倍(P＜0．05)。hsa-miＲ-508-5p对mut-MAPK1没有作用。证实hsa-miＲ-508-5p能靶向作用于MAPK13'-UTＲ互补位点，抑制其表达，而敲除其作用位点，不具有靶向关系(图4A)。同时列出了MAPK1荧光素酶相对活性及miＲ-508-5p与MAPK1靶向位点预测(图4B)。2．4重组过表达载体转染HEK-293T利用脂质体将鉴定的阳性重组pSicoＲ-miＲ-508-5p表达载体转染到HEK-293T细胞，相差显微镜下观察GFP荧光表达情况(图5)。2．5Westernblot通过Westernblot法检测MAPK1蛋白的表达水平，证实感染pSicoＲ-miＲ-508-5p重组慢病毒的293T细胞中MAPK1蛋白表达量较正常293T细胞中明显降低，而转染了miＲ-508inhibitor组MAPK1蛋白表达水平又明显升高(图6)，说明pSicoＲ-miＲ-508-5p直接靶标MAPK1白静等miＲ-508-5p慢病毒过表达载体构建及对MAPK1/EＲK信号通路靶向抑制作用的研究第1期·37·

图2pSicoＲ-miＲ-508-5p过表达载体测序结果Fig．2SequencingresultsofpSicoＲ-miＲ-508-5poverexpressionvector图3Ｒeport-MAPK13'-UTＲ重组质粒测序结果Fig．3Sequencingresultsofreport-MAPK13'-UTＲplasmid图4双荧光素酶报告系统验证miＲ-508-5p与MAPK1靶向抑制作用，共转染海蜃荧光素酶做内对照Fig．4TovarifythetargetedinhibitionbetweenmiＲ-508-5pandMAPK1withluciferasereportersystem，co-transfectionluciferaseofseamirageasaninternalcontrolNote:*．P＜0．05．2．3双荧光素酶报告系统hsa-miＲ-508-5p过表达载体组明显抑制MAPK1的荧光素酶活性，与正常对照组相比下降约6倍(P＜0．05);而转染了hsa-miＲ-508-5pinhibitor组，MAPK1的荧光素酶活性又明显升高约1．5倍(P＜0．05)。hsa-miＲ-508-5p对mut-MAPK1没有作用。证实hsa-miＲ-508-5p能靶向作用于MAPK13'-UTＲ互补位点，抑制其表达，而敲除其作用位点，不具有靶向关系(图4A)。同时列出了MAPK1荧光素酶相对活性及miＲ-508-5p与MAPK1靶向位点预测(图4B)。2．4重组过表达载体转染HEK-293T利用脂质体将鉴定的阳性重组pSicoＲ-miＲ-508-5p表达载体转染到HEK-293T细胞，相差显微镜下观察GFP荧光表达情况(图5)。2．5Westernblot通过Westernblot法检测MAPK1蛋白的表达水平，证实感染pSicoＲ-miＲ-508-5p重组慢病毒的293T细胞中MAPK1蛋白表达量较正常293T细胞中明显降低，而转染了miＲ-508inhibitor组MAPK1蛋白表达水平又明显升高(图6)，说明pSicoＲ-miＲ-508-5p直接靶标MAPK1白静等miＲ-508-5p慢病毒过表达载体构建及对MAPK1/EＲK信号通路靶向抑制作用的研究第1期·37·


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