人溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

发布时间：2021-01-23 17:44

　　目的　利用巴斯德毕赤 （Pichia pastoris）酵母真核表达系统 ,构建真核表达载体 p PIC9K与人溶菌酶基因 （humanlysozyme,h L Y）的重组质粒 p PIC9K- h L Y,表达出具有活性的人溶菌酶 .方法　此项研究在本实验室构建的人溶菌酶（h L Y）基因与 p UC19的重组质粒 p UC19- h L Y的基础上 ,通过设计一对引物 ,用多聚酶链式反应 （PCR）扩增出人溶菌酶全基因片段后 ,将其克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体p PIC9K中 ,构建重组质粒 p PIC9K- h L Y,经 Bg1 酶切线性化后 ,用电穿孔法将其转入毕赤酵母细胞内 .通过 G418筛选 ,选到的高拷贝转化子经 PCR检测人溶菌基因与毕赤酵母染色体是否稳定整合 ,阳性克隆经甲醇诱导进行表达 .结果　序列测定 ,经 PCR扩增后的人溶菌酶基因与文献发表的序列相比 ,缺失 4个碱基 .我们决定采用重组 PCR法予以纠正 ,经序列测定结果正确 .用 PCR检测 ,人溶菌酶基因与毕赤酵母染色体稳定整合 .用甲醇诱导表达并以 SDS- PAGE分析 ,在 Mr为 15 ... 

【文章来源】：第四军医大学学报. 2001,(22)北大核心

【文章页数】：5 页

【文章目录】：
0 引言
1 材料和方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 重组质粒pPIC9K-hLY的构建
        1.2.2 转染毕赤酵母菌
        1.2.3 PCR检测hLY基因与毕赤酵母染色体基因组的整合
        1.2.4 人溶菌酶基因的表达和鉴定
2 结果
    2.1 PCR扩增hLY基因及重组质粒pPIC9K-hLY的酶切鉴定
    2.2 PCR分析hLY基因与毕赤酵母菌 （SMD1168） 染色体基因组的整合
    2.3 表达产物的鉴定
        2.3.1 SDS-PAGE测定
        2.3.2 抗原性测定
        2.3.3 活性测定
3 讨论


【参考文献】：
期刊论文
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博士论文
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本文编号：2995638