重组胱抑素C的表达及免疫活性分析

发布时间：2017-04-13 01:21

  本文关键词：重组胱抑素C的表达及免疫活性分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:1.表达和纯化重组的人胱抑素C(cystatin C,Cys C)蛋白;2.鉴定纯化的重组Cys C蛋白;3.重组Cys C蛋白的免疫活性的检测。方法:1.根据Gen Bank中人Cys C功能区的氨基酸序列,选择大肠埃希菌喜好的编码密码子设计合成编码基因序列,利用PCR(聚合酶链式反应)获取目的片段,在原核系统中表达重组人胱抑素C蛋白。2.纯化表达的Cys C重组蛋白,用间接酶联免疫吸附测定法(间接ELISA法)测定其反应灵敏度及免疫活性。结果:1.PCR扩增Cys C后经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,在250~500bp位置处发现唯一一条清晰的、大小约为450bp的DNA条带,相对分子质量大小与Cys C基因大小相符,因此可初步确定为目的条带。构建的重组载体p MD18-T-Cys C,经Bam H I和Xho I双酶切鉴定后可见两条条带,与预期结果一致,经过上海生工公司测序,证明为Cys C编码序列;2.将连接表达载体的连接物诱导表达,SDS-PAGE后发现诱导后的菌株表达了一个大小约为35k D的蛋白,而在对照组中没有出现这一条带,初步说明重组基因在大肠杆菌中获得了有效表达;3.Western Blotting结果显示,表达的重组蛋白与抗Cys C多克隆抗体在大小约为35k D处发生了反应,而阴性对照则没有此条带的出现,进一步说明了重组蛋白为Cys C蛋白,并且具有良好的免疫反应活性;4.间接ELISA结果显示,在包被浓度为0.5mg/L时便产生了阳性值(一般以阴性值的2.1倍设为临界值),表明该重组蛋白具有极高的反应灵敏度。结论:1.成功建立了Cys C原核表达系统;2.Cys C重组蛋白具有良好的反应灵敏度;3.Cys C重组蛋白免疫小鼠后血清中Ig G效价已达制备单克隆抗体的要求,为Cys C单克隆抗体的制备打下夯实的基础。
【关键词】：CysC 原核表达 反应灵敏度 免疫活性分析
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 1. 引言11-13
• 2. 试剂和方法13-27
• 2.1 仪器与试剂13-19
• 2.1.1 主要仪器13-14
• 2.1.2 主要试剂14-15
• 2.1.3 常用溶液和培养基配方15-19
• 2.2 实验方法19-20
• 2.2.1 CysC目的片段的优化合成和引物探针设计与合成19
• 2.2.2 PCR扩增CysC的反应体系及反应条件19
• 2.2.3 PCR产物凝胶电泳及回收19-20
• 2.2.4 E.coli Top10F’感受态细胞的制备20
• 2.3 CysC克隆载体的构建20-22
• 2.3.1 目的片段和pMD18-T载体连接20-21
• 2.3.2 连接物的转化21
• 2.3.3 重组克隆质粒的提取及测序21-22
• 2.3.4 重组克隆质粒的酶切鉴定及凝胶电泳22
• 2.4. CysC表达载体的构建22-23
• 2.4.1 回收的基因片段和表达载体pET-32a的连接22-23
• 2.4.2 感受态表达菌株ER2566的制备23
• 2.5 CysC目的蛋白的表达和鉴定23-27
• 2.5.1 CysC目的蛋白的小量诱导表达23-24
• 2.5.2 CysC目的蛋白活性鉴定24
• 2.5.3 重组Cys C蛋白的纯化与鉴定24-25
• 2.5.4 间接ELISA检测重组蛋白的抗原反应性25-26
• 2.5.5 间接ELISA检测重组蛋白的免疫原性26-27
• 3. 结果27-33
• 3.1 CysC基因扩增产物的鉴定27
• 3.2 重组CysC克隆质粒的鉴定27-28
• 3.3 重组CysC表达质粒的构建和酶切鉴定28
• 3.4 CysC重组蛋白的诱导表达28-29
• 3.5 CysC重组蛋白表达方式鉴定及纯化29-30
• 3.6 CysC重组蛋白的免疫反应性鉴定30-31
• 3.7 间接ELISA检测CysC重组蛋白反应灵敏度31
• 3.8 间接ELISA检测CysC重组蛋白免疫原性31-33
• 4. 讨论33-36
• 5. 结论36-37
• 参考文献37-40
• 综述40-57
• 参考文献47-57
• 读研期间发表的论文57
• 读研期间参与的课题57-58
• 缩略词对照表58-59
• 致谢59-60

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 杨霄鹏;吕同德;刘斌;王晓辉;唐瑜;贾庆华;;重组人脂联素融合蛋白在大肠埃希菌BL21中的表达[J];兰州大学学报(医学版);2011年01期

2 向礼贤;血清胱抑素C检测与疾病[J];四川医学;2004年11期

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本文编号：302495