人巨细胞病毒pUL38激活mTORC1的机制研究

发布时间：2017-04-14 18:08

  本文关键词：人巨细胞病毒pUL38激活mTORC1的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人巨细胞病毒是β型疱疹病毒家族中的成员,能感染多种不同的细胞类型。人巨细胞病毒的感染是导致新生儿出生缺陷的主要原因之一,此外它能在免疫缺陷的人中引起严重的疾病。这种病毒一旦感染了宿主之后,就不能被宿主的免疫系统彻底清除,之后它将以一种潜伏感染的形式终生存在,并且在宿主体内反复感染发作。作为细胞专噬性病毒,人巨细胞病毒已经进化出了多种机制在宿主细胞内创造一种有利于自身生存和复制的环境。由于m TORC1在调控细胞内蛋白合成及同化代谢等方面都起着非常重要的作用,因此它常常成为病毒调控的作用靶标。许多病毒都已进化出了多种多样的机制或通过直接作用于m TORC1或间接作用于m TORC1的上下游分子来激活细胞内m TORC1这条重要的信号通路。尽管人巨细胞病毒在感染之后会引起细胞内环境的压力,但是它依然能维持高活性的m TORC1水平。已有研究报道人巨细胞病毒中的多功能蛋白p UL38能通过结合并拮抗TSC2来激活m TORC1,p UL38也能抑制在巨细胞病毒感染过程中由内质网压力所诱导的细胞凋亡。本研究中我们揭示了p UL38的N端截短突变体p UL3825-331在抑制细胞凋亡方面具有完整的功能。然而有趣的是p UL3825-331虽然失去了结合TSC2的能力但它却依然能够激活m TORC1,尽管和全长的p UL38相比稍微弱了一点。表达p HA-UL3825-331的重组病毒产生病毒的能力和野生型病毒相比大约降低了10倍,这表明p UL38和TSC2的相互作用在产生有效病毒方面的重要性。通过利用点突变分析的方法我们确认了p UL38中位于第23和24位的氨基酸基序TQ对于其和TSC2的相互作用是极其重要的。更重要的是,当过表达突变体p HA-UL38 TQ/AA时,它能够像p HA-UL3825-331一样激活m TORC1。通过利用CRISPR基因编辑技术我们构建了TSC2敲除的U373-MG单克隆细胞系,并且揭示了p UL38在TSC2敲除的细胞中能够更进一步地激活m TORC1。因此本研究确定了p UL38中对p UL38和TSC2相互作用来说所重要的TQ氨基酸基序,并且阐明了p UL38能通过TSC2依赖和不依赖2种方式激活m TORC1。
【关键词】：人巨细胞病毒 p UL38 m TORC1 TSC2
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R373.11
【目录】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 绪论9-15
• 第一节 人巨细胞病毒简介9-11
• 1.1 人巨细胞病毒的结构及基因组9-10
• 1.2 人巨细胞病毒的致病性10-11
• 1.3 人巨细胞病毒的传播11
• 第二节HCMV病毒蛋白PUL3811-15
• 第二章15-44
• 第一节 研究背景15-17
• 第二节 研究目的和方法17
• 第三节 实验材料17-20
• 3.1 载体和重组质粒17-18
• 3.2 实验试剂和抗体18
• 3.3 主要实验仪器与耗材18-19
• 3.4 实验用细胞和病毒19-20
• 第四节 实验方法20-25
• 4.1 细胞冻存与复苏20-21
• 4.2 细胞传代培养21
• 4.3 细胞计数21
• 4.4 HCMV病毒扩增21-22
• 4.5 病毒滴定（TCID50）22-23
• 4.6 病毒生长曲线23
• 4.7 蛋白免疫印迹法23-24
• 4.8 免疫共沉淀24-25
• 4.9 HF细胞中shRNR敲低TSC225
• 4.10 构建TSC2 敲除的U373-MG单克隆细胞25
• 第五节 实验结果分析25-40
• 5.1 表达pUL38 一系列N端截短体的HCMV病毒的构建和分析25-29
• 5.2 在HCMV病毒感染过程中，，pUL3825-331 蛋白在不结合TSC2 的情况下依然能激活mTORC129-32
• 5.3 单独过表达pUL3825-331 时，它能以一种不依赖于TSC2 的方式激活mTORC132-33
• 5.4 氨基酸基序TQ对于PUL38 与TSC2 之间的相互作用是必要的33-35
• 5.5 点突变体pUL38 TQ/AA和pUL38 E/A表现出与突变体pUL3825-331 相同的功能35-38
• 5.6 在TSC2 敲除的细胞中pUL38 能更进一步地激活mTORC138-40
• 第六节 讨论40-44
• 参考文献44-51
• 攻读学位期间发表文章51-52
• 致谢52-53

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本文编号：306538