利用TrueBlot抗体改善内源性蛋白的免疫沉淀/免疫印迹分析

发布时间：2021-03-21 12:55

　　目的:改善内源性蛋白的免疫沉淀/免疫印迹分析中免疫沉淀抗体对免疫印迹检测带来的干扰。方法:收集培养的Hela细胞或FLAG标记的S5b基因表达载体转染的Hela细胞,制备全细胞裂解液,分别加入特异性抗体沉淀S5b并洗脱,收集免疫复合物,通过SDS-PAGE分离,采用HRP标记的TrueBlot抗体或常规二抗,对S5b及其相互作用蛋白（Rpt1和Rpt2）进行免疫印迹检测。结果:得到了清晰的S5b,Rpt1和Rpt2条带。结论:TrueBlot抗体能明显消除免疫沉淀抗体的干扰,是内源性蛋白免疫沉淀后进行免疫印迹分析的理想工具。 

【文章来源】：中南大学学报(医学版). 2014,39(07)北大核心CSCD

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【部分图文】：

外源性S5b的免疫共沉淀/免疫印迹分析

696中南大学学报(医学版),2014,39(7)http://www.csumed.org2.2内源性S5b的免疫沉淀分析当细胞内源性S5b被抗体沉淀后，采用常规二抗进行免疫印迹分析时，在23kD和55kD的位置出现IgG的轻链和重链条带(图2)，信号宽且弥散，遮盖了分子质量接近轻链或重链的目的条带，从而对S5b的辨识产生了严重的干扰作用，当免疫印迹和免疫沉淀时所用抗体来自相同种属时尤其明显。采用TrueBlot抗体作为二抗检测可得到清晰的S5b条带，而不出现抗体的重链和轻链条带，显著降低免疫沉淀抗体带来的干扰，得到理检测效果。2.3S5b及其结合蛋白的相互作用能够与S5b免疫共沉淀的Rpt1和Rpt22[3-6]，分子质量为49kD[2]，接近重链大小，采用TrueBlot二抗检测可得到清晰的条带(图3)。3讨论免疫共沉淀-免疫印迹分析研究蛋白质间的相互作用，可以设计包含目的蛋白和标签肽的融合基因表达质粒，转染细胞并表达，通过标签肽免疫沉淀目的蛋白并行免疫印迹分析。通常这种方法通过标签肽的作用可取得很好的检测效果，如图1所示。但由于质粒过表达生成的蛋白质可能驱动非生理性的两种蛋白质间的相互作用[1]，所以一般宜用于分析蛋白质间特定的相互作用。采用免疫沉淀/免疫印迹法检测内源性蛋白质相互作用一直以来是个难题。比如，分子质量接近55kD的蛋白酶体亚基Rpt1，Rpt2[2]，以及分子质量接近23kD的多种α和β亚基等[2]，该法效果不佳。免疫复合物中的免疫沉淀抗体，电泳前在加样缓冲液所含巯基乙醇和加热的作用下，还原变性并解离为约55kD的重链条带和23kD的轻链条带，经电泳分离并转移至印迹膜上；免疫印迹抗体用于检测免疫沉淀物中的兴趣蛋白，与印迹膜一起4℃孵育过夜，保持了非还原的天然结构。免疫印迹中使用的常规二抗，能结合?

哂〖７治鍪保??3kD和55kD的位置出现IgG的轻链和重链条带(图2)，信号宽且弥散，遮盖了分子质量接近轻链或重链的目的条带，从而对S5b的辨识产生了严重的干扰作用，当免疫印迹和免疫沉淀时所用抗体来自相同种属时尤其明显。采用TrueBlot抗体作为二抗检测可得到清晰的S5b条带，而不出现抗体的重链和轻链条带，显著降低免疫沉淀抗体带来的干扰，得到理检测效果。2.3S5b及其结合蛋白的相互作用能够与S5b免疫共沉淀的Rpt1和Rpt22[3-6]，分子质量为49kD[2]，接近重链大小，采用TrueBlot二抗检测可得到清晰的条带(图3)。3讨论免疫共沉淀-免疫印迹分析研究蛋白质间的相互作用，可以设计包含目的蛋白和标签肽的融合基因表达质粒，转染细胞并表达，通过标签肽免疫沉淀目的蛋白并行免疫印迹分析。通常这种方法通过标签肽的作用可取得很好的检测效果，如图1所示。但由于质粒过表达生成的蛋白质可能驱动非生理性的两种蛋白质间的相互作用[1]，所以一般宜用于分析蛋白质间特定的相互作用。采用免疫沉淀/免疫印迹法检测内源性蛋白质相互作用一直以来是个难题。比如，分子质量接近55kD的蛋白酶体亚基Rpt1，Rpt2[2]，以及分子质量接近23kD的多种α和β亚基等[2]，该法效果不佳。免疫复合物中的免疫沉淀抗体，电泳前在加样缓冲液所含巯基乙醇和加热的作用下，还原变性并解离为约55kD的重链条带和23kD的轻链条带，经电泳分离并转移至印迹膜上；免疫印迹抗体用于检测免疫沉淀物中的兴趣蛋白，与印迹膜一起4℃孵育过夜，保持了非还原的天然结构。免疫印迹中使用的常规二抗，能结合天然的免疫印迹抗体显示待测蛋白；而免疫沉淀抗体用量通常很大，因此常规二抗也往往会与印迹膜上的抗体重链和轻链结合，显示相应的条带，条


本文编号：3092896