S100B基因的克

发布时间：2021-04-07 18:32

　　目的 本研究用逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chainreaction简称RT-PCR）的方法获得S100B基因，构建表达S100B蛋白的重组质粒，使之高效表达S100B蛋白。研究表达蛋白质的生物学活性，并通过亲和层析的方法纯化融合蛋白，为S100B作用机制和应用研究奠定基础。 方法 应用RT-PCR的方法获得S100B基因，插入克隆载体，鉴定重组质粒并进行基因序列测定和分析；纯化S100B基因片段并插入原核表达载体，诱导表达目的蛋白，鉴定融合蛋白S100B蛋白-麦芽糖结合蛋白（S100B-MBP蛋白，简称MBS）。利用亲和层析方法纯化MBS蛋白；获得融合蛋白的免疫血清，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清S100B抗体效价，蛋白印迹法（Western blot）检验融合蛋白的生物学活性。 结果 1、含S100B基因的重组质粒S100B-pMD 18T vector（简称pTS），经双酶切后和特异PCR，证实S100B基因的重组克隆质粒构建成功。经测序，S100B基因全长320bp。GenBan... 

【文章来源】：郑州大学河南省 211工程院校

【文章页数】：65 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
S100B基因的克隆、原核表达及生物学活性研究
    前言
    研究总技术线路
    实验材料
        1 常用生化试剂
        2 主要仪器设备
        3 质粒与菌株
        4 培养基及常用溶液的配制
    实验方法
        1 S100B基因克隆与序列分析
            1.1 S100B基因克隆技术路线
            1.2 S100B基因重组质粒构建示意图
            1.3 组织总RNA提取
            1.4 引物的设计与合成
            1.5 RT-PCR扩增
            1.6 PCR产物DNA片段回收
            1.7 感受态细胞的制备
            1.8 质粒重组及鉴定
            1.9 S100B克隆基因序列测定
            1.10 序列的比较分析
        2 MBS融合蛋白在原核表达载体pMAL-c2x中的表达
            2.1 技术路线
            2.2 pTS融合基因与pMAL-c2x的重组质粒构建示意图
            2.3 表达融合蛋白重组质粒pMAL-S100B的构建过程
            2.4 融合蛋白MBS的表达
            2.5 融合蛋白诱导表达条件的优化
            2.6 SDS-PAGE电泳
            2.7 Western blot（蛋白印迹法）
            2.8 TB1（pMS）的大量诱导表达
            2.9 融合蛋白在细胞内的定位（即可溶性分析）
            2.10 融合蛋白MBS的纯化
            2.11 融合蛋白MBS免疫兔血清的制备
            2.12 ELISA法检测兔血清效价
    结果与分析
        1 S100B基因的克隆与同源性分析
            1.1 组织和细胞总RNA提取
            1.2 S100B基因RT-PCR扩增结果
            1.3 S100B基因的克隆及鉴定
        2 融合蛋白MBS在TB1（pMS）中的表达
            2.1 重组质粒pMS的构建及鉴定
            2.2 融合蛋白MBS的诱导表达结果
            2.3 Western blot鉴定融合蛋白MBS
            2.4 表达蛋白可溶性分析结果
            2.5 融合蛋白pMS在TB1（pMS）中表达条件的优化
            2.6 融合蛋白MBS亲和层析纯化结果
        3 融合蛋白MBS的生物学活性检测
            3.1 免疫血清的制备及血清效价测定
            3.2 免疫兔血清抗体成分分析
讨论
结论
参考文献
综述
英文略缩词
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]含PRPL启动子的原核高效表达载体的组建及其应用[J]. 张智清,姚立红,侯云德.  病毒学报. 1990(02)



本文编号：3123974