新型人钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制蛋白hCaMKIINα的克隆及其生物学功能研究

发布时间：2021-04-07 18:33

　　钙离子是重要的第二信使，在细胞生长、分化过程中起着重要的作用，Ca²⁺／CAM可磷酸化多种酶，其中钙离子／钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）是其重要靶分子。CaMKⅡ是一种多功能的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，广泛分布表达于多种器官组织，可在体内磷酸化40多种具有重要生理功能的蛋白分子包括酶、离子通道、转录因子等等：CaMKⅡ可以调控碳水化合物、氨基酸、脂肪的代谢，神经递质的合成与释放，转录因子的转录，细胞骨架的构建，细胞周期的进程，DNA损伤的修复等等生理病理过程。近年来有些研究结果提示CaMKⅡ在细胞的生长、分化过程中起着十分重要的作用，也有人认为CaMKⅡ是细胞周期顺利进行的必需分子。 CaMKⅡ抑制剂的发现和应用是研究CaMKⅡ生理功能的有效途径。CaMKⅡ抑制剂可通过与Ca²⁺／CAM结合位点的相互结合或影响催化功能来抑制CaMKⅡ的活性，从而阻断CaMKⅡ对其底物的磷酸化或调节某些基因的转录，诱导肿瘤细胞发生凋亡、坏死、生长阻滞，该方面研究可为临床肿瘤治疗提供新的策略和方向。因此，发现新型CaMKⅡ抑制剂是一项很有理论探索意义和... 

【文章来源】：中国人民解放军海军军医大学上海市 211工程院校

【文章页数】：74 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

hCaMKI州a与其它CaMKH抑制蛋白的同源分析

2.5人hcaMKllNa的细胞与组织分布利用Rl’-PCR方法对14种人造血肿瘤细胞系及实体肿瘤细胞系进行了hCaMKllNamRNA表达的检测。结果如图1一5所示。造血系肿瘤细胞中，在B淋巴瘤细胞Daudi、非T非B型急性淋巴细胞白血病细胞Reh、组细胞白血病U937、慢性髓系白血病细胞K562等细胞中检测到了hCaMKllNamRNA的表达，其中Reh细胞表达量较高，而急性早幼粒细胞白血病细胞NB4和T淋巴瘤细胞MOLT-4中未见表达。在实体肿瘤细胞中，宫颈癌HeLa、乳腺癌MCF一7、前列腺癌PC一3细胞、脑胶质瘤A172、肝癌SMMC7721、肺癌A549、卵巢癌CaoV-3等细胞均以不同程度表达hCaMKllNamRNA，其中在HeLa、MCF一7和PC一3细胞中表达量较高。而LoVc和HT-29两种人结肠腺癌细胞未见hCaMKI取a表达。因此在后续实验中我们选择了人结肠腺癌LoVo细胞，利用基因转染和瘤体内电脉冲导入等方法进行体外及体内hCaMKllNa生物学功能的研究。图1一5肿瘤细胞中CaMKIma表达?

2一3PhysiealmapofexPressionPeDNA3.1/His一Mye(一)BveetorheaMKllNaPCR产物纯化后经刀口阴Hl/关{indlll双酶切与peDNA3.l/mye一hisCB)载体(质粒图谱见图2一3)，按常规方法重组并转化至感受态细菌DH5a(氯化钙法)。挑取克隆进行鉴定、纯化并测序。测序正确克隆分别记为peDNA一KHNa、pe恻A一KllNal二;、penNA一KllNal.53、penNA一KllNal一65。真核表达载体的构建过程见图2一4。1.4hCaMKllNa重组GST融合蛋白的诱导表达及纯化挑表达阳性的pGEx一KllNa、pGEX一KlxNar碑l、poEx一KllNa卜53、pGEX一KllNal一65和pGEX一27peptide的BLZI克隆，接种于1oomlLB培养基中，37oC250rPm/min振荡培养12一15hr，以l:100转接于200mlLB振荡培养，待细菌生长至对数生长期，加loomMIPTo至o.ZmM后300e诱导2一6hr，5


本文编号：3123975