多重耐药性鲍曼不动杆菌噬菌体的筛选及其理化性质与生物信息学分析

发布时间：2017-04-19 15:15

  本文关键词：多重耐药性鲍曼不动杆菌噬菌体的筛选及其理化性质与生物信息学分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:本研究探索应用裂解性噬菌体防控医院中普遍存在的多重耐药鲍曼不动杆菌,为多重耐药菌的防控提供一条新途径。同时,对该菌的特异裂解性噬菌体的理化性质进行分析,并对其进行全基因组测序分析,从分子水平及基因水平上评价该噬菌体的施用安全性。方法:从医院病人的血液组织中分离纯化病原菌,经形态学观察、生理生化实验、16S r RNA序列分析、药敏实验分析对病原菌进行分类鉴定并确定其耐药性。将分离的病原菌作为宿主菌,采用双层平板法从医院废水中分离得到该菌的特异裂解性噬菌体。该噬菌体纯化后,通过透射电镜观察,考察其氯仿敏感性、p H稳定性、宿主谱、潜伏期、裂解量等噬菌体生物学特性,将筛选获得的裂解性噬菌体命名为PAb-3。随后,将该噬菌体的悬浮液进行氯化铯密度梯度离心,采用常规的酚-氯仿-异戊醇提取方法对该噬菌体的全基因组进行提取,并对其进行全基因组测序,采用相应的测序分析软件分析该噬菌体的基因组成成分及相应的基因功能。结果:经检验科的生理生化分析及16S r RNA序列分析,确定该病原菌为鲍曼不动杆菌(A.baumannii),命名为AB0815。药敏实验结果表明,该病原菌为耐第四代头孢菌素类的多重耐药性菌株。本实验分离筛选的噬菌体可在双层琼脂平板上形成圆形透亮大小均一、直径约0.8mm的噬菌斑。透射电镜观察结果显示,噬菌体PAb-3头部衣壳直径为90±3nm,体长为205±4nm,形态学鉴定该噬菌体属肌尾噬菌体科(Myoviridae)。噬菌体PAb-1感染宿主菌的潜伏期为25min,裂解期为65min,爆发量达243PFU/infected cell。该噬菌体对宿主菌AB0815专一性强,对氯仿不敏感。SDS-PAGE电泳结果显示,噬菌体PAb-3含有8个条带,表明其至少含有8个结构蛋白,其中浓度最高的条带代表了噬菌体的衣壳蛋白。全基因组测序分析结果显示,该噬菌体的基因组大小为44,781bp,G+C%为42.14%(A=29.56%、T=28.30%、G=20.18%、C=21.96%)。基因组生物信息学分析结果显示,该噬菌体基因组含有44个CDS,经过NCBI比对分析,有23个基因确定功能,且该噬菌体不包含毒力因子及内毒素合成基因。结论:该病原菌为耐第四代头孢菌素类的多重耐药性菌株,并筛选到该菌的裂解性噬菌体一株。噬菌体的一步生长曲线结果表明,该噬菌体潜伏期短,裂解周期短,裂解性强。该噬菌体对宿主菌AB0815专一性强,对氯仿不敏感。该噬菌体不包含毒力因子及内毒素合成基因,说明了该噬菌体的安全性较高,具有潜在的应用价值。亲缘关系分析结果显示,该噬菌体的分类地位为有尾噬菌体目,肌尾噬菌体科,T4噬菌体属。
【关键词】：鲍曼不动杆菌 细菌耐药性 噬菌体 基因组测序分析 进化分析
【学位授予单位】：大连大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 引言12-14
• 1 致病菌的分离鉴定14-22
• 1.1 实验用品14-16
• 1.1.1 实验材料14
• 1.1.2 实验试剂14
• 1.1.3 实验仪器设备14-15
• 1.1.4 试剂配制15-16
• 1.1.516SrRNA引物设计16
• 1.2 实验方法16-17
• 1.2.1 病原菌的分离培养及保藏16
• 1.2.2 病原菌的分类鉴定16-17
• 1.2.3 病原菌的生理生化鉴定17
• 1.2.4 病原菌的耐药性分析17
• 1.3 实验结果17-21
• 1.3.1 病原菌的分离纯化结果17-18
• 1.3.2 病原菌的电镜观察结果18-19
• 1.3.3 病原菌生理生化指标测定结果19-20
• 1.3.4 病原菌药敏实验结果20
• 1.3.5 病原菌 16SrRNA序列分析结果20-21
• 1.4 小结21-22
• 2 致病菌特异性噬菌体的筛选及理化性质分析22-33
• 2.1 实验用品22-24
• 2.1.1 实验材料22
• 2.1.2 实验试剂22
• 2.1.3 实验仪器与设备22-23
• 2.1.4 试剂的配制23-24
• 2.2 实验方法24-28
• 2.2.1 噬菌体的分离纯化24-26
• 2.2.2 噬菌体透射电镜观察26
• 2.2.3 氯仿敏感性测试26
• 2.2.4 噬菌体宿主谱26
• 2.2.5 噬菌体吸附速率测定26-27
• 2.2.6 噬菌体一步生长曲线27
• 2.2.7 噬菌体对温度、pH耐受性27
• 2.2.8 噬菌体体外抑菌实验27-28
• 2.2.9 统计分析28
• 2.3 实验结果及分析28-32
• 2.3.1 噬菌体的分离纯化结果28
• 2.3.2 噬菌体的电镜观察结果28-29
• 2.3.3 噬菌体氯仿敏感性测试结果29
• 2.3.4 噬菌体宿主谱检测结果29-30
• 2.3.5 噬菌体吸附速率测定结果30
• 2.3.6 噬菌体一步生长曲线结果30-31
• 2.3.7 噬菌体对温度、pH的耐受性测试结果31-32
• 2.3.8 噬菌体PhageAb-3 的体外裂解实验结果32
• 2.4 小结32-33
• 3 噬菌体基因组的提取及其全基因组测序分析33-52
• 3.1 实验用品33-35
• 3.1.1 实验材料33
• 3.1.2 实验试剂33-34
• 3.1.3 实验仪器与设备34
• 3.1.4 试剂配制34-35
• 3.2 实验方法35-39
• 3.2.1 噬菌体颗粒的浓缩35-36
• 3.2.2 噬菌体颗粒的纯化36
• 3.2.3 噬菌体全基因组提取36-37
• 3.2.4 噬菌体全基因组琼脂糖凝胶电泳分析及其全蛋白电泳分析293.2.5 噬菌体PAb-3 全基因组测序37
• 3.2.5 噬菌体 PAb-3 全基因组测序37-38
• 3.2.6 噬菌体PAb-3 核酸结构鉴定38
• 3.2.7 噬菌体PAb-3 功能基因组学分析38
• 3.2.8 噬菌体PAb-3 同源性分析38-39
• 3.3 实验结果与分析39-51
• 3.3.1 噬菌体PAb-3 的全基因组提取结果39
• 3.3.2 噬菌体PAb-3 的全蛋白SDS-PAGE电泳结果39-40
• 3.3.3 噬菌体PAb-3 的基因结构鉴定结果40
• 3.3.4 噬菌体PAb-3 基因组一般性质分析结果40-43
• 3.3.5 噬菌体PAb-3 基因组CDS预测结果43-45
• 3.3.6 噬菌体PAb-3 基因分布统计结果45
• 3.3.7 噬菌体PAb-3 基因组功能基因注释与分析45-49
• 3.3.8 噬菌体PAb-3 亲缘关系分析结果49-51
• 3.4 小结51-52
• 讨论52-54
• 结论54-55
• 参考文献55-57
• 综述57-71
• 参考文献67-71
• 附录A AB0815 的 16S rRNA测序结果71-72
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况72-73
• 致谢73

【参考文献】

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本文编号：316555