BCL10介导LPS/TLR4信号通路的机制研究

发布时间：2021-05-08 07:33

　　先天免疫又称固有免疫或天然免疫,是机体防御病原体的第一道防线。在先天免疫系统中,不同吞噬细胞如嗜中性粒细胞和树突细胞等通过来自Toll样受体（TLR）的信号而辨别出病原体及“自己”。在启动先天免疫对抗病原体的过程中最重要的一步就是识别,由杀伤细胞的受体识别存在于病原体而不存在于细胞中的成分,这称为病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern, PAMP）。不同的TLR识别的PAMP不同,例如TLR4可以识别革兰氏阴性菌的LPS。在这里,我们证明T细胞和IκB激酶复合体间的重要信号分子BCL10与先天免疫系统有关,并参与了TLR4途径及核因子κB（NF-κB）的激活。BCL10作为一个在适应性免疫信号转导中的信号分子,其在TCR通路中的作用机制已经得到了很好的说明,我们的工作发现,BCL10不仅在适应性免疫中具有信号转导功能,而且在先天免疫中也有这种作用,它能在细菌LPS刺激下,参与LPS/TLR4途径,最后引起NF-κB的活化,我们还提出了这条通路中针对BCL10的负反馈调节模型。在这里,我们对其作用机制进行了研究,发现在LPS刺激下,... 

【文章来源】：武汉大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：163 页

【学位级别】：博士

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英文摘要
第一章 前言
    1. 先天免疫概述
        1.1 先天免疫的主要效应细胞
        1.2 先天免疫识别的基本模式
    2. Toll 样受体（Toll-like receptor）
        2.1 TLR/IL-1R 受体超家族的结构特点
            2.1.1 胞内区的 TIR 结构域
            2.1.2 胞外区 LRR 序列
        2.2 Toll 家族成员在机体防御中的作用
        2.3 TLR4 及其配体
        2.4 TLR/IL-1R 信号通路
            2.4.1 MyD88 依赖的信号通路（MyD88-dependent pathway）
            2.4.2 非 MyD88 依赖的信号通路（MyD88-independent pathway）
            2.4.3 其它参加 TLR 信号通路的分子
    3. T淋巴细胞抗原受体的信号转导
        3.1 TCR
        3.2 TCR 的信号转导
            3.2.1 配体识别引起 TCR 聚集
            3.2.2 Src 家族蛋白酪氨酸激酶的活化
            3.2.3 TCR/CD3 胞浆区酪氨酸磷酸化
            3.2.4 Syk 家族蛋白酪氨酸激酶的募集和活化
            3.2.5 接头分子的募集
            3.2.6 PKC 途径中的下游分子
            3.2.7 NF-κB 的活化及转录的激活
    4. 转录因子
        4.1 NF-κB
            4.1.1 NF-κB 的结构与组成
            4.1.2 IκB 家族
            4.1.3 IKK 激酶
            4.1.4 NF-κB 的活化
        4.2 P53
            4.2.1 P53 的结构与功能
            4.2.2 P53 的活化及调节
        4.3 STAT 家族
            4.3.1 STAT 家族成员的组成与结构
            4.3.2 STAT 蛋白的活化及调节
    5. Pellino 的研究
        5.1 Pellino1
        5.2 Pellino2
        5.3 Pellino3
    6. BCL10 的研究
        6.1 BCL10 的发现及结构
        6.2 BCL10 的功能
            6.2.1 BCL10 能诱发细胞凋亡
            6.2.2 BCL10 能激活 NF-κB
            6.2.3 BCL10 能抑制细胞转化
            6.2.4 BCL10 在免疫系统中的作用
            6.2.5 BCL10 与肿瘤的关系
    7. IRAK 的研究
        7.1 IRAK 蛋白家族成员的功能
        7.2 IRAK 分子在 TLR 信号通路中的正调节作用
        7.3 IRAK 分子在 TLR 信号通路中的负调节作用
        7.4 IRAK 成为了炎症和感染疾病中新的药物治疗靶点
第二章 常规研究技术
    2.1 分子生物学实验技术
        2.1.1 质粒 DNA 的小量制备
        2.1.2 质粒 DNA 的大量制备
        2.1.3 质粒 DNA 的纯化
        2.1.4 DNA 限制性酶消化
        2.1.5 低熔点琼脂糖凝胶法回收 DNA 片断
        2.1.6 玻璃奶(glass-milk)法回收 DNA 片断
        2.1.7 用试剂盒从琼脂糖凝胶中回收 DNA
        2.1.8 DNA 片段和载体的连接
        2.1.9 冷氯化钙法制备新鲜感受态细胞
        2.1.10 电转化感受态细胞的制备
        2.1.11 质粒 DNA 的常规转化
        2.1.12 质粒 DNA 的快速转化法
        2.1.13 质粒 DNA 的电转化法
        2.1.14 PCR 扩增目的基因
        2.1.15 PCR 定点诱变
    2.2 细胞学实验技术
        2.2.1 细胞培养基的配制
        2.2.2 细胞传代培养
        2.2.3 细胞转染
    2.3 分子生物学实验技术
        2.3.1 用原核表达系统表达蛋白
        2.3.2 Bac-to-Bac 表达系统
            A. 目的基因的克隆
            B. 转座
            C. 重组Bacmid DNA 的分离
            D. 重组穿梭载体Bacmid DNA 的提取制备
            E. PCR 鉴定
            F. Bacmid DNA 转染 Sf-9 细胞
            G. 收获重组病毒
            H. 重组病毒感染昆虫细胞
        2.3.3 Ni++亲和层析法纯化蛋白质
        2.3.4 免疫共沉淀
        2.3.5 Western Blot
        2.3.6 GST 树脂pull-down 分析
        2.3.7 T7 Select 噬菌体展示技术
            A 噬菌体展示技术筛选流程
            B 阳性克隆的筛选方法
            C 噬菌体 DNA 的制备
        2.3.8 RNA 干扰
第三章 BCL10 与 Pellino2 的结合对 LPS/TLR4 信号通路的调控
    3.1 引言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 质粒与细胞
        3.2.2 抗体，试剂及文库
        3.2.3 RAW264.7 细胞的培养
        3.2.4 RNA 干扰
    3.3 研究结果
        3.3.1 重组质粒的构建和鉴定
        3.3.2 BCL10 在原核细胞中的表达
        3.3.3 BCL10 蛋白的纯化
        3.3.4 BCL10 相互作用蛋白的筛选
        3.3.5 LPS 刺激下 BCL10 与 Pellino2 的相互作用
        3.3.6 LPS 处理或过表达 BCL10 的条件下 Pellino2 引发的 NF-κB 活化
        3.3.7 BCL10 是 LPS 诱导 NF-κB 活化的关键信号分子
        3.3.8 LPS 招募 BCL10 到 TLR4 信号复合物上
        3.3.9 SOCS3 对 BCL10 诱导的 NF-κB 活化和iNOS 表达有负调控作用
        3.3.10 SOCS3 对 Pellino2 与 BCL10 的相互作用的负调控
        3.3.11 SOCS3 阻断 TLR4 复合物对 BCL10 的招募
    3.4 讨论
第四章 BCL10 与 IRAK1 的结合对 LPS/TLR4 信号途径的调控
    4.1 前言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 菌株、质粒与细胞
        4.2.2 试剂、抗体及文库
        4.2.3 重组质粒的构建
        4.2.4 PCR 定点诱变
        4.2.5 siRNA 靶序列的设计和siRNA 载体的构建
        4.2.6 甘油梯度超速离心
    4.3 研究结果
        4.3.1 重组质粒的构建与鉴定
        4.3.2 BCL10 蛋白的表达纯化
        4.3.3 BCL10 相关蛋白的筛选
        4.3.4 LPS 刺激下内源性 BCL10 与 IRAK1 的体内相互作用
        4.3.5 IRAK1 与 BCL10 相互作用功能区的鉴定
        4.3.6 BCL10 与 IRAK1 相互作用功能区的鉴定
        4.3.7 IRAK1可以招募BCL10到TLR4受体复合物中
        4.3.8 BCL10 传递了 IRAK1 下游的信号
        4.3.9 BCL10 必须寡聚化后才能传递 LPS 信号
        4.3.10 IRAK1 的寡聚化引起 BCL10 的寡聚化
    4.4 讨论
第五章 MALT1 与 Pellino2/BCL10 的结合对 LPS/TLR4 信号途径的调控
    5.1 前言
    5.2 材料和方法
        5.2.1 质粒、细胞抗体及试剂
        5.2.2 RNAi
        5.2.3 细胞浆和细胞膜成分的分离
    5.3 研究结果
        5.3.1 MALT1 参与了 LPS/TLR4 信号转导
        5.3.2 MALT1 与细胞质中 BCL10 和 TRAF6 的相互作用
        5.3.3 在 IRAK1 降解后,Pellino2 介导 BCL10 和 TRAF6 的作用
    5.4 讨论
研究总结和创新点
参考文献
博士期间发表和待发表的论文
致谢



本文编号：3174938