胱天蛋白酶募集域蛋白9?麦芽糖结合蛋白融合蛋白的原核表达及纯化

发布时间：2021-05-08 13:21

　　目的胱天蛋白酶募集域蛋白9（CARD9）可激活核因子?κB（NF?κB）、丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）等通路参与免疫,但其作用机制至今尚未阐明。为进行相关体外实验,构建CARD9?麦芽糖结合蛋白（MBP）融合蛋白的原核表达载体,并对融合蛋白进行表达鉴定及纯化。方法利用PCR技术分别扩增CARD9和MBP基因的编码序列,将两者正确插入pET?30a（+）载体中得到重组质粒,后转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞中,并进行PCR和酶切鉴定以及基因测序。将正确的重组质粒转化至大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞,筛选不同条件进行IPTG诱导表达,通过SDS?PAGE电泳检测目的蛋白质的相对分子质量。通过MBP麦芽糖层析柱和分子筛层析柱对CARD9?MBP融合蛋白进行纯化,用HRV3C蛋白酶酶切去除MBP标签后进行MALDI?TOF质谱鉴定。结果成功构建CARD9?MBP融合蛋白的原核表达载体,PCR和酶切鉴定为阳性且基因测序结果与目的序列一致。SDS?PAGE电泳显示,在大肠埃希菌BL21（DE3）中成功诱导表达出相对分子质量约为105 000的目的蛋白。通过MBP麦芽糖层析柱的初步纯化... 

【文章来源】：医学研究生学报. 2019,32(03)北大核心

【文章页数】：7 页

【文章目录】：
0 引言
1 材料与方法
    1.1 LB培养基
    1.2 主要试剂和仪器
    1.3 方法
        1.3.1 目的基因的扩增
        1.3.2 重组质粒pET-30a (+) -CARD9-MBP的构建及鉴定
        1.3.3 不同诱导条件下CARD9-MBP融合蛋白的表达
        1.3.4 CARD9-MBP融合蛋白的MBP层析纯化
        1.3.5 CARD9-MBP融合蛋白的蛋白酶酶切
        1.3.6 CARD9-MBP融合蛋白的分子筛层析纯化
2 结果
    2.1 目的基因的扩增
    2.2 重组质粒pET-30a (+) -CARD9-MBP的构建及鉴定
    2.3 CARD9-MBP融合蛋白的表达
    2.4 CARD9-MBP融合蛋白的MBP层析纯化
    2.5 CARD9-MBP融合蛋白的HRV3C蛋白酶酶切
    2.6 CARD9-MBP融合蛋白的分子筛层析纯化
3 讨论


【参考文献】：
期刊论文
[1]功能性受体钠离子牛磺胆酸共转运蛋白-Huh7细胞株的构建及其HBV易感性[J]. 朱甜甜,李毓雯,胡平平,李军,朱传龙.  医学研究生学报. 2018(11)
[2]Tiam1截短体融合蛋白的原核表达与纯化[J]. 黄静,张余琴,陈龙华,丁轶.  医学研究生学报. 2017(09)
[3]播散性暗色丝孢霉病患者CARD9突变及相关免疫学研究[J]. 张瑞珺,王晓雯,万喆,李若瑜.  微生物与感染. 2017(01)
[4]胱天蛋白酶募集域蛋白9在胃癌中的表达及作用机制研究[J]. 林贵德,周春丽,何海春.  中国临床研究. 2016(02)



本文编号：3175410