猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B2基因的原核表达、纯化以及免疫反应性分析

发布时间：2021-05-31 19:37

　　目的原核表达猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B2基因,分析重组蛋白的免疫反应性。方法参照GenBank中Ts8B2基因序列设计引物,以合成基因为模板获得预期DNA片段,双酶切后连接至原核表达载体pGEX-4T-1。将重组质粒转化入大肠埃希菌DH5α（E.coli DH5α）,PCR、双酶切筛选阳性质粒,测序确认后转化至E.coli Rosstea,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测表达产物。尿素法提取重组蛋白,然后以脑囊虫病患者血清为一抗,Western blot分析其免疫反应性。结果 Ts8B2基因PCR扩增产物为258 bp,与理论值一致。双酶切和测序鉴定重组表达质粒构建成功,SDS-PAGE分析重组质粒转化菌表达相对分子质量为3.5×10³,以包涵体形式存在目的蛋白,Western blot分析尿素法提取的重组蛋白能被脑囊虫患者血清识别。结论成功构建Ts8B2基因重组表达质粒表达的重组蛋白具有免疫反应性,为进一步研究该蛋白在抗体检测中的应用奠定了基础。 

【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2019,14(02)北大核心CSCD

【文章页数】：4 页

【部分图文】：

图１Ｔｓ８Ｂ２基因ＰＣＲ扩增结果ＭＤＮＡｍａｒｋｅｒ１ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＴｓ８Ｂ２ｇｅｎｅＭＤＮＡ标志物１Ｔｓ８Ｂ２基因ＰＣＲ扩增产物

Ｔ－１－Ｔｓ８Ｂ２的构建及鉴定Ｔｓ８Ｂ２基因ＰＣＲ扩增产物经ＢａｍＨⅠ和ＸｈｏⅠ双酶切纯化后用Ｔ４连接酶连接到原核表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１，连接产物转化至Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α感受态细胞。挑选阳性克隆，抽提质粒，双酶切后得到约２５０ｂｐ的酶切目的片段（图２），与Ｔｓ８Ｂ２基因大小基本相符。测序显示重组质粒插入序列与目的序列一致，重组质粒构建成功。ＭＤＮＡ标志物１重组质粒的ＢａｍＨⅠ和ＸｈｏⅠ双酶切图２重组表达质粒酶切鉴定ＭＤＮＡｍａｒｋｅｒ１ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－Ｔｓ８Ｂ２ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｂｙＢａｍＨⅠａｎｄＸｈｏⅠＦｉｇ．２Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｃａｎｔｐｌａｓｍｉｄｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ３重组蛋白的诱导表达及ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析重组质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－Ｔｓ８Ｂ２转化表达菌Ｅ．ｃｏｌｉＲｏｓｓｔｅａ（命名为ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－Ｔｓ８Ｂ２／Ｒｏｓｓｔｅａ）后经ＩＰＴＧ诱导４ｈ，用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测表达产物，结果见图３。重组菌高效表达的ｒＴｓ８Ｂ２蛋白相对分子质量为３５×１０３（目的蛋白为９．８×１０３，ＧＳＴ标签蛋白为２６×１０３），与预期值相符。空质粒转化菌ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／Ｒｏｓｓｔｅａ诱导后无此蛋白条带。Ｍ蛋白分子质量标准１ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／Ｒｏｓｓｔｅａ对照２ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－Ｔｓ８Ｂ２／Ｒｏｓｓｔｅａ经ＩＰＴＧ诱导４ｈ图３重组蛋白ｒＴ

／Ｒｏｓｓｔｅａ）后经ＩＰＴＧ诱导４ｈ，用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测表达产物，结果见图３。重组菌高效表达的ｒＴｓ８Ｂ２蛋白相对分子质量为３５×１０３（目的蛋白为９．８×１０３，ＧＳＴ标签蛋白为２６×１０３），与预期值相符。空质粒转化菌ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／Ｒｏｓｓｔｅａ诱导后无此蛋白条带。Ｍ蛋白分子质量标准１ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／Ｒｏｓｓｔｅａ对照２ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－Ｔｓ８Ｂ２／Ｒｏｓｓｔｅａ经ＩＰＴＧ诱导４ｈ图３重组蛋白ｒＴｓ８Ｂ２的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ＭＰｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ１ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／ＲｏｓｓｔｅａｉｎｄｕｃｔｅｄｂｙＩＰＴＧ２ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－Ｔｓ８Ｂ２／ＲｏｓｓｔｅａｉｎｄｕｃｔｅｄｂｙＩＰＴＧｆｏｒ４ｈＦｉｇ．３ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｃａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ４ｒＴｓ８Ｂ２的纯化超声裂解ＩＰＴＧ诱导４ｈ的ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－Ｔｓ８Ｂ２／Ｒｏｓｓｔｅａ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示重组蛋白ｒＴｓ８Ｂ２以包涵体的形式存在于菌体中。对包涵体进行纯化复性，纯化后的蛋白进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析结果见图４。纯化的重组蛋白分子质量与理论值吻合且为单一条带。ＢＣＡ法测定纯化的蛋白浓度为１．４ｍｇ／ｍｌ。Ｍ蛋白分子质量标准２纯化的ｒＴｓ８Ｂ２图４纯化的ｒＴｓ８Ｂ２ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ＭＰｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ１ＰｕｒｉｆｉｅｄｒＴｓ８Ｂ２Ｆｉｇ．４ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎ５ｒＴ

【参考文献】：
期刊论文
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[2]猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B3基因的原核表达、纯化以及免疫反应性分析[J]. 李瑾,肖婷,孙慧,魏庆宽,贾凤菊,黄炳成.  中国病原生物学杂志. 2018(05)
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本文编号：3208850