抗人t-PSA单克隆抗体的制备及化学发光检测方法的建立

发布时间：2021-06-01 01:30

　　目的:制备抗人前列腺癌特异性抗原（t-PSA）单克隆抗体,建立t-PSA的化学发光CLIA检测方法。方法:t-PSA抗原免疫小鼠后,通过细胞融合、HTS筛选、扩大培养及亲和纯化后得到t-PSA单克隆抗体（mAb）,测定抗体亲和力、特异性及表位,最后选择抗不同表位的单克隆抗体建立双抗体夹心CLIA检测方法。结果:获得4株阳性信号较强的抗人t-PSA的mAb（3-21-1、3-26-1、3-40-1、3-41-1）。用3-21-1 mAb-HRP和3-26-1 mAb-HRP建立的CLIA体系检测范围为0.1～100 ng/ml,最低检测限为0.09 ng/ml,相对偏差均在±5%之内,与肿瘤标志物CEA、AFP、Myo无交叉反应。与罗氏试剂检测t-PSA结果对比,一致性检验KAPPA系数为0.933,相关系数为0.936,两组数据具有较好的一致性和相关性。结论:本研究成功制备了抗人t-PSA mAb,建立了定量检测t-PSA的双抗体夹心CLIA方法。 

【文章来源】：中国免疫学杂志. 2019,35(13)北大核心CSCD

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

抗t-PSA单克隆抗体的制备流程Fig．1Preparationprocessofanti-t-PSAmAb

亓矗??25kD左右清晰可见单抗的轻链，如图3所示。2.2.2特异性鉴定t-PSA包含f-PSA、c-PSA，因此选定t-PSA、f-PSA和c-PSA蛋白包被［14］，另外选取2种普遍的癌症筛查蛋白AFP和CEA包被，对纯化后的抗体采用间接ELISA方法测定其OD值。如图4所示，4种单克隆抗体均不与AFP和CEA有交叉反应，而与目的蛋白t-PSA、f-PSA和c-PSA有阳性反应。2.2.3亲和力测定将3-21-1mAb、3-26-1mAb、3-40-1mAb和3-41-1mAb应用BiacoreX100进行图2t-PSA第3次免疫小鼠后的效价Fig．2Titerafterthirdt-PSAimmunizationinmice图3SDS-PAGE检测纯化后t-PSA单克隆抗体Fig．3SDS-PAGEanalysisofanti-t-PSAmonoclonalanti-bodyafterpurificationNote:M.Molecularweightmarker;1.3-21-1mAb;2.3-26-1mAb;3.3-40-1mAb;4.3-41-1mAb.抗体亲和力测定，其亲和力均达10－10，结果如表1。2.2.4表位竞争鉴定将3-26-1mAb进行HRP酶标记，测定其最佳工作浓度为1∶1×104。将t-PSA蛋白包被，用3-26-1-HRP与其他3株抗体进行竞争ELISA反应，结果如图5，3-26-1mAb与3-41-1mAb有竞争，与3-21-1mAb、3-40-1mAb都没有竞争反应，即3-26-1mAb与3-21-1mAb、3-40-1mAb分别针对t-PSA不同表位，可以进行夹心反应。2.2.5抗体的亚型鉴定筛选到的4株单克隆抗体的轻链均为κ链，3-21-1mAb与3-40-1mAb的重链为IgG2a，3-26-1mAb与3-41-1mAb重链为IgG2b。2.3夹心CLIA检测t-PSA方法的建立及评价图4t-PSA单克隆抗体与相关蛋白的交叉反应Fig．

包含f-PSA、c-PSA，因此选定t-PSA、f-PSA和c-PSA蛋白包被［14］，另外选取2种普遍的癌症筛查蛋白AFP和CEA包被，对纯化后的抗体采用间接ELISA方法测定其OD值。如图4所示，4种单克隆抗体均不与AFP和CEA有交叉反应，而与目的蛋白t-PSA、f-PSA和c-PSA有阳性反应。2.2.3亲和力测定将3-21-1mAb、3-26-1mAb、3-40-1mAb和3-41-1mAb应用BiacoreX100进行图2t-PSA第3次免疫小鼠后的效价Fig．2Titerafterthirdt-PSAimmunizationinmice图3SDS-PAGE检测纯化后t-PSA单克隆抗体Fig．3SDS-PAGEanalysisofanti-t-PSAmonoclonalanti-bodyafterpurificationNote:M.Molecularweightmarker;1.3-21-1mAb;2.3-26-1mAb;3.3-40-1mAb;4.3-41-1mAb.抗体亲和力测定，其亲和力均达10－10，结果如表1。2.2.4表位竞争鉴定将3-26-1mAb进行HRP酶标记，测定其最佳工作浓度为1∶1×104。将t-PSA蛋白包被，用3-26-1-HRP与其他3株抗体进行竞争ELISA反应，结果如图5，3-26-1mAb与3-41-1mAb有竞争，与3-21-1mAb、3-40-1mAb都没有竞争反应，即3-26-1mAb与3-21-1mAb、3-40-1mAb分别针对t-PSA不同表位，可以进行夹心反应。2.2.5抗体的亚型鉴定筛选到的4株单克隆抗体的轻链均为κ链，3-21-1mAb与3-40-1mAb的重链为IgG2a，3-26-1mAb与3-41-1mAb重链为IgG2b。2.3夹心CLIA检测t-PSA方法的建立及评价图4t-PSA单克隆抗体与相关蛋白的交叉反应Fig．4Cross-reactionanalysisofanti-t-PSAmonoclonalantibodywithrelatedprotein表1anti-

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3209387