人CREG启动子报告基因质粒的构建及转录活性分析
发布时间：2021-06-06 15:38
目的构建人E1A激活基因阻遏子基因（hCREG）不同截短片段的启动子增强型绿色荧光蛋白（pEGFP1）报告基因载体,比较各启动子转录活性,从而确定hCREG核心启动子区。方法通过查询美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库hCREG序列并结合启动子特点,获得长度为2003（–1925/+78） bp的启动子片段。利用PCR法及双酶切法截短5个启动子片段并克隆至pEGFP1中,构建pEGFP1hCREG2003、pEGFP1hCREG945、pEGFP1hCREG586、pEGFP1hCREG478、pEGFP1hCREG358报告基因载体质粒。并将其与内参质粒pGL4.73[hRluc/SV40]瞬时共转染入293T细胞48 h,荧光显微镜下观察pEGFP1hCREG启动子报告基因的绿色荧光表达;采用实时定量PCR检测各启动子mRNA的表达,并确...
【文章来源】：解放军医学杂志. 2019,44(07)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
图2双酶切或PCR法获得4个hCREG基因上游DNA片段Fig.2FourDNAfragmentsofhCREGbyPCRordouble
MedJChinPLA,Vol.44,No.7,July28,2019589图3琼脂糖凝胶电泳双酶切鉴定Fig.3DNAplasmididentifiedbyrestrictionendonucleasesdigestionA.pEGFP1_hCREG_2003；B.pEGFP1_hCREG_945；C.pEGFP1_hCREG_586；D.pEGFP1_hCREG_478；E.pEGFP1_hCREG_358图2双酶切或PCR法获得4个hCREG基因上游DNA片段Fig.2FourDNAfragmentsofhCREGbyPCRordoubleenzymedigestionM.DL-2000-DNA-Marker；1-4.目的DNA片段长度分别为945、586、478bp和358bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp945bp586bp478bp358bpM123410000bp7000bp4000bp2000bp1000bp500bp250bpABCDE图4质粒pEGFP1_hCREG_586部分基因测序结果Fig.4PartofDNAplasmidpEGFP1_hCREG_586identifiedbysequencing
告基因mRNA表达水平Fig.6mRNAexpressionlevelsoffivepEGFP1_hCREGpromoterreportergenes(Quantitativereal-timePCR)与pEGFP1_hCREG_2003比较，(1)P<0.05；与pEGFP1_hCREG_945比较，(2)P<0.05；与pEGFP1_hCREG_586比较，(3)P<0.05；与pEGFP1_hCREG_478比较，(4)P<0.05(n=6，F=62.440)。2.01.51.00.50hCERGmRNA(/GAPDH)pEGFP1_hCREG_2003pEGFP1_hCREG_945pEGFP1_hCREG_586pEGFP1_hCREG_478pEGFP1_hCREG_358(1)(2)(3)(1)(2)(3)(4)图7生物信息学预测hCREG基因–508/–281片段可能结合的转录因子Fig.7BioinformaticspredictedpotentialtranscriptionfactorsboundinthehCREGgene–508/–281bpfragment区域(翻译起始位点ATG为下游+79)不同截短片段的pEGFP1报告基因载体，行缺失验证，以求获得hCREG基因核心启动子序列。本研究采用的GFP基因的优点在于不需要抗体、辅助因子或酶底物等其他介质，携带GFP的融合蛋白在荧光显微镜下，用紫外线激发后即可观察到绿色荧光，直观、简便，而且灵敏度不受反应效率的影响，保证了极高的检出率。另外GFP无种属特异性，在原核和真核生物中均可表达[9]；蛋白本身性质稳定，具有在真核细胞中稳定表达的抗生素筛选基因，且因其分子量小，无细胞毒性。但也存在对于不同的蛋白浓度、离子强度、温度和pH
【参考文献】：
期刊论文
[1]ING5基因对乳腺癌细胞Bcap-37恶性表型的影响[J]. 宋洋,万义增,赵树鹏,齐凤杰,方磊,伍继成,时帅,郑华川. 解放军医学杂志. 2017(01)
[2]慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白转染大鼠角膜的效率及其毒性研究[J]. 刘立,赵敏. 解放军医学杂志. 2014(04)
[3]转录因子E2F1抑制CREG表达调控体外培养的人血管平滑肌细胞分化[J]. 韩雅玲,赵昕,闫承慧,康建,张效林,邓捷,徐红梅,刘海伟. 生物化学与生物物理进展. 2007(05)
本文编号：3214671
【文章来源】：解放军医学杂志. 2019,44(07)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
图2双酶切或PCR法获得4个hCREG基因上游DNA片段Fig.2FourDNAfragmentsofhCREGbyPCRordouble
MedJChinPLA,Vol.44,No.7,July28,2019589图3琼脂糖凝胶电泳双酶切鉴定Fig.3DNAplasmididentifiedbyrestrictionendonucleasesdigestionA.pEGFP1_hCREG_2003；B.pEGFP1_hCREG_945；C.pEGFP1_hCREG_586；D.pEGFP1_hCREG_478；E.pEGFP1_hCREG_358图2双酶切或PCR法获得4个hCREG基因上游DNA片段Fig.2FourDNAfragmentsofhCREGbyPCRordoubleenzymedigestionM.DL-2000-DNA-Marker；1-4.目的DNA片段长度分别为945、586、478bp和358bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp945bp586bp478bp358bpM123410000bp7000bp4000bp2000bp1000bp500bp250bpABCDE图4质粒pEGFP1_hCREG_586部分基因测序结果Fig.4PartofDNAplasmidpEGFP1_hCREG_586identifiedbysequencing
告基因mRNA表达水平Fig.6mRNAexpressionlevelsoffivepEGFP1_hCREGpromoterreportergenes(Quantitativereal-timePCR)与pEGFP1_hCREG_2003比较，(1)P<0.05；与pEGFP1_hCREG_945比较，(2)P<0.05；与pEGFP1_hCREG_586比较，(3)P<0.05；与pEGFP1_hCREG_478比较，(4)P<0.05(n=6，F=62.440)。2.01.51.00.50hCERGmRNA(/GAPDH)pEGFP1_hCREG_2003pEGFP1_hCREG_945pEGFP1_hCREG_586pEGFP1_hCREG_478pEGFP1_hCREG_358(1)(2)(3)(1)(2)(3)(4)图7生物信息学预测hCREG基因–508/–281片段可能结合的转录因子Fig.7BioinformaticspredictedpotentialtranscriptionfactorsboundinthehCREGgene–508/–281bpfragment区域(翻译起始位点ATG为下游+79)不同截短片段的pEGFP1报告基因载体，行缺失验证，以求获得hCREG基因核心启动子序列。本研究采用的GFP基因的优点在于不需要抗体、辅助因子或酶底物等其他介质，携带GFP的融合蛋白在荧光显微镜下，用紫外线激发后即可观察到绿色荧光，直观、简便，而且灵敏度不受反应效率的影响，保证了极高的检出率。另外GFP无种属特异性，在原核和真核生物中均可表达[9]；蛋白本身性质稳定，具有在真核细胞中稳定表达的抗生素筛选基因，且因其分子量小，无细胞毒性。但也存在对于不同的蛋白浓度、离子强度、温度和pH
【参考文献】：
期刊论文
[1]ING5基因对乳腺癌细胞Bcap-37恶性表型的影响[J]. 宋洋,万义增,赵树鹏,齐凤杰,方磊,伍继成,时帅,郑华川. 解放军医学杂志. 2017(01)
[2]慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白转染大鼠角膜的效率及其毒性研究[J]. 刘立,赵敏. 解放军医学杂志. 2014(04)
[3]转录因子E2F1抑制CREG表达调控体外培养的人血管平滑肌细胞分化[J]. 韩雅玲,赵昕,闫承慧,康建,张效林,邓捷,徐红梅,刘海伟. 生物化学与生物物理进展. 2007(05)
本文编号：3214671
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