一种肠肌间神经丛胶质细胞无血清原代培养法的建立
发布时间：2021-06-09 13:42
目的肠胶质细胞（enteric glial cell,EGC）在肠道多种生理及病理过程的调节中发挥重要作用,为了深入研究EGC的功能,排除在体及组织水平中神经体液因素的影响,获得一种简便高效的原代EGC分离培养方法非常必要。方法取小鼠结肠纵行肌-肌间神经丛组织,经消化分离肠胶质细胞,采用含血清和无血清培养基交替培养法去除成纤维细胞后常规传代;运用细胞免疫荧光染色法检测原代EGC纯度;运用胞内钙成像技术实时观察EGC内Ca2+浓度（[Ca2+]i）变化以检测细胞活性。结果每次实验获得的EGC至传代前细胞量可达约6. 8×105;无血清培养后成纤维细胞污染显著降低;胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）阳性的EGC占细胞总数的98. 44%±1. 07%,钙结合蛋白S100β阳性EGC占93. 61%±3. 16%,GFAP与S100β双阳性EGC占93. 09%±2. 99%; 96. 00%±4. 00%的细胞在ATP诱导下发生胞内钙瞬变。结论结合无血清培养可有效去除成纤维细胞污染,得到纯度较高、活性较好的肌间神经丛EGC。
【文章来源】：首都医科大学学报. 2019,40(02)北大核心
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
EGC在结肠肌间神经丛的分布
首都医科大学学报第40卷1.5统计学方法应用GraphPadPrism6.0进行统计学分析，计量数据以均数±标准差(x±s)表示。2结果2.1EGC在结肠肌间神经丛的分布胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)是目前较常用的成熟EGC标志物，小鼠结肠组织水平免疫荧光双标记结果显示，GFAP阳性的EGC在肌间神经丛大量分布，并与神经元标志物神经原纤维(neurofilament，NF)不共存，表明GFAP可作为结肠EGC的标志物，详见图1。2.2原代EGC纯度运用EGC标志物GFAP免疫荧光标记EGC，观察其在原代细胞中的比例，结果显示运用含血清培养基培养的原代细胞中，只有部分细胞表现出GFAP阳性，以平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin，α-SMA)与GFAP双标记染色可见，GFAP阴性的细胞多表现为α-SMA阳性，且胞核呈卵圆形，符合成纤维细胞的特征(图2A)，表明含血清培养基培养的原代细胞中存在大量的成纤维细胞污染。运用无血清培养后，可见原代细胞中绝大多数细胞均呈现GFAP阳性图1EGC在结肠肌间神经丛的分布Fig.1DistributionofEGCincolonicmyentericplexusA:double-labelimmunofluorescenceofGFAPandNFinmyentericplexusofcolon;NF:neurofilament;GFAP:glialfibrillaryacidicprotein;EGC:entericglialcell．图2原代EGC细胞纯度Fig.2PurityofprimaryEGCA:double-labelimmunofluorescenceofGFAPandα-SMAinserum-containingculturedEGC;B:double-labelimmunofluorescenceofGFAPandS100－βinserum-freeculturedEGC;EGC:entericglialcell;GFAP:glialfibrillaryacidicprotein;α-SMA:α-smoothmuscleactin．432
诮邮蹵TP刺激后可表现出显著的胞内钙瞬变，而成纤维细胞则不具备这种特性。以Ca2+荧光探针fluo-4AM孵育细胞，给予10μmol/LATP，利用荧光显微数码成像系统检测探针荧光强度，动态观察细胞内［Ca2+］i的变化。如图3所示，静息状态下胞内［Ca2+］i维持在较平稳的水平，ATP给药后，96.00%±4.00%，95%CI为(84.89，107.1)的细胞发生胞内钙瞬变，结果来自3批细胞共6次实验，主要表现为胞内［Ca2+］i在短时间内快速升高(Fm/F0=1.93±0.08)随后又迅速恢复至基线水平的周期性变化，提示原代EGC反应性良好。图3ATP引起原代EGC胞内钙瞬变Fig.3ATPinducedCa2+transientsinprimaryEGCA:representativeimagesofprimaryEGCloadedwithFluo-4atrest(left)anduponactivation(right)withATP(10μmol/L);scalebar:70μm;B:representativetracesofATP-inducedCa2+transientsforthreeindividualcells;EGC:entericglialcell．3讨论肌间神经丛EGC原代培养过程中，成纤维细胞在操作中难以去除，在细胞培养过程中分裂增生十分迅速，因此成为制约EGC原代培养的关键因素。本实验室利用成纤维细胞对血清依赖生长的特性，在现有肌间神经丛EGC原代培养方法［9］中结合无血清法，较特异地去除了成纤维细胞污染。本实验前期，本课题组参考了Smith等［9］建立的小鼠原代EGC分离方法，成功分离了小鼠结肠EGC，但在细胞鉴定中观察到大量GFAP阴性而α-SMA阳性的细胞，提示原代细胞中存在成纤维细胞污染。在运用无血清法培养后，可见GFAP阴性细胞显著减少，表明无血清培养法可有效去除成纤维细胞污染。Smith等［9］的文章中并未统计原代细胞纯度，本实验中，统计GFAP阳性细胞占比超过98%，95%CI为(95.70，101.2)，表明纯度较高，
【参考文献】：
期刊论文
[1]Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier[J]. Yan-Bo Yu,Yan-Qing. World Journal of Gastroenterology. 2014(32)
[2]无血清饥饿法去除神经组织培养中的成纤维细胞[J]. 历俊华,万虹,翟晶,王忠诚. 首都医科大学学报. 2004(02)
本文编号：3220685
【文章来源】：首都医科大学学报. 2019,40(02)北大核心
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
EGC在结肠肌间神经丛的分布
首都医科大学学报第40卷1.5统计学方法应用GraphPadPrism6.0进行统计学分析，计量数据以均数±标准差(x±s)表示。2结果2.1EGC在结肠肌间神经丛的分布胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)是目前较常用的成熟EGC标志物，小鼠结肠组织水平免疫荧光双标记结果显示，GFAP阳性的EGC在肌间神经丛大量分布，并与神经元标志物神经原纤维(neurofilament，NF)不共存，表明GFAP可作为结肠EGC的标志物，详见图1。2.2原代EGC纯度运用EGC标志物GFAP免疫荧光标记EGC，观察其在原代细胞中的比例，结果显示运用含血清培养基培养的原代细胞中，只有部分细胞表现出GFAP阳性，以平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin，α-SMA)与GFAP双标记染色可见，GFAP阴性的细胞多表现为α-SMA阳性，且胞核呈卵圆形，符合成纤维细胞的特征(图2A)，表明含血清培养基培养的原代细胞中存在大量的成纤维细胞污染。运用无血清培养后，可见原代细胞中绝大多数细胞均呈现GFAP阳性图1EGC在结肠肌间神经丛的分布Fig.1DistributionofEGCincolonicmyentericplexusA:double-labelimmunofluorescenceofGFAPandNFinmyentericplexusofcolon;NF:neurofilament;GFAP:glialfibrillaryacidicprotein;EGC:entericglialcell．图2原代EGC细胞纯度Fig.2PurityofprimaryEGCA:double-labelimmunofluorescenceofGFAPandα-SMAinserum-containingculturedEGC;B:double-labelimmunofluorescenceofGFAPandS100－βinserum-freeculturedEGC;EGC:entericglialcell;GFAP:glialfibrillaryacidicprotein;α-SMA:α-smoothmuscleactin．432
诮邮蹵TP刺激后可表现出显著的胞内钙瞬变，而成纤维细胞则不具备这种特性。以Ca2+荧光探针fluo-4AM孵育细胞，给予10μmol/LATP，利用荧光显微数码成像系统检测探针荧光强度，动态观察细胞内［Ca2+］i的变化。如图3所示，静息状态下胞内［Ca2+］i维持在较平稳的水平，ATP给药后，96.00%±4.00%，95%CI为(84.89，107.1)的细胞发生胞内钙瞬变，结果来自3批细胞共6次实验，主要表现为胞内［Ca2+］i在短时间内快速升高(Fm/F0=1.93±0.08)随后又迅速恢复至基线水平的周期性变化，提示原代EGC反应性良好。图3ATP引起原代EGC胞内钙瞬变Fig.3ATPinducedCa2+transientsinprimaryEGCA:representativeimagesofprimaryEGCloadedwithFluo-4atrest(left)anduponactivation(right)withATP(10μmol/L);scalebar:70μm;B:representativetracesofATP-inducedCa2+transientsforthreeindividualcells;EGC:entericglialcell．3讨论肌间神经丛EGC原代培养过程中，成纤维细胞在操作中难以去除，在细胞培养过程中分裂增生十分迅速，因此成为制约EGC原代培养的关键因素。本实验室利用成纤维细胞对血清依赖生长的特性，在现有肌间神经丛EGC原代培养方法［9］中结合无血清法，较特异地去除了成纤维细胞污染。本实验前期，本课题组参考了Smith等［9］建立的小鼠原代EGC分离方法，成功分离了小鼠结肠EGC，但在细胞鉴定中观察到大量GFAP阴性而α-SMA阳性的细胞，提示原代细胞中存在成纤维细胞污染。在运用无血清法培养后，可见GFAP阴性细胞显著减少，表明无血清培养法可有效去除成纤维细胞污染。Smith等［9］的文章中并未统计原代细胞纯度，本实验中，统计GFAP阳性细胞占比超过98%，95%CI为(95.70，101.2)，表明纯度较高，
【参考文献】：
期刊论文
[1]Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier[J]. Yan-Bo Yu,Yan-Qing. World Journal of Gastroenterology. 2014(32)
[2]无血清饥饿法去除神经组织培养中的成纤维细胞[J]. 历俊华,万虹,翟晶,王忠诚. 首都医科大学学报. 2004(02)
本文编号：3220685
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