Cj致Hartley豚鼠周围神经病模型—百日咳毒素剂量范围及灌喂频率的探索性研究

发布时间：2017-04-23 11:00

  本文关键词：Cj致Hartley豚鼠周围神经病模型—百日咳毒素剂量范围及灌喂频率的探索性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一部分:0.1μg~20μg范围的百日咳毒素与Cj致Hartley豚鼠周围神经纤维病变率没有剂量依赖关系目的:百日咳毒素可促进空肠弯曲菌致Hartley豚鼠周围神经病变模型的形成,但是剂量范围尚不清楚,观察0.1μg~20μg的百日咳毒素对空肠弯曲菌(Campylobacter jejune,Cj)致Hartley豚鼠周围神经纤维病变率的影响。方法:1制备菌悬液:从空肠弯曲菌菌株库中选取lulei株作为实验菌株,用哥伦比亚血培养基于42℃,10%CO2、5%O2、85%N2条件培养空肠弯曲菌。纯化菌种,制备3×108cfu/ml菌悬液,准备为Hartley豚鼠灌胃。2制备百日咳毒素注射液:在百日咳毒素粉剂(50μg)中加入50μl蒸馏水,备以配制不同浓度的PT注射液,准备为Hartley豚鼠腹腔注射。3实验分组:将12只SPF级4周龄Hartley豚鼠随机分为5组实验组和1组对照组,每组2只,实验组分为:A组:0.1μg百日咳毒素+3×108cfu/ml Cj菌悬液;B组:1μg百日咳毒素+3×108cfu/ml Cj菌悬液;C组:2μg百日咳毒素+3×108cfu/ml Cj菌悬液;D组:10μg百日咳毒素+3×108cfu/ml Cj菌悬液;E组:20μg百日咳毒素+3×108cfu/ml Cj菌悬液。对照组F组为空白对照组。4攻毒方案:攻毒前Hartley豚鼠禁食15h,禁水3h,实验组各组豚鼠用相应剂量的PT注射液腹腔注射,次日各实验组豚鼠给予空肠弯曲菌lulei株3×108cfu/ml菌悬液口服灌喂,2ml/只。攻毒结束后半小时给食水。各实验组均攻毒一次。5实验动物的临床症状观察及解剖取材:自灌喂当日起每日观察豚鼠的肢体活动、精神状况、饮食、皮毛、粪便等情况。临床症状参考Hartley豚鼠EAN模型的瘫痪评分标准[1]:将瘫痪程度分为0~5级,0级:无异常;1级:两后肢脚趾轻微拖拽地面;2级:两后肢脚趾较明显拖地,但未累及其他部位;3级:两后肢显著拖地,常见两后肢偏向同一侧;4级:两后肢完全瘫痪;5级:四肢肢体活动均受累,甚至出现呼吸抑制。于攻毒结束后4周取材,每组取一只豚鼠深度麻醉后活体取材,取左侧坐骨神经浸于4%的多聚甲醛中固定后锇酸染色,右侧坐骨神经做冰冻切片后进行HE染色和Gomori染色。每组的另一只豚鼠经4%的多聚甲醛灌注后取材,取双侧坐骨神经保存于4%的多聚甲醛中用于锇酸染色。6观察神经病理变化及统计分析:光学显微镜下观察坐骨神经锇酸染色、HE染色及Gomori染色的病理结果。体式显微镜下每只豚鼠随机分离100根神经单根纤维,计算周围神经纤维病变率(周围神经纤维病变率=病变神经单根纤维数/100×100%)。采用χ2分割法分析各组之间周围神经纤维病变率有无统计学差异,采用χ2检验,分析每组豚鼠活体取材和灌注后取材周围神经纤维病变率,进行统计学差异分析。结果:1豚鼠的临床症状:对照组豚鼠在整个实验过程中精神、饮食均可,且未出现肢体活动障碍现象及皮毛较脏等异常现象。实验组豚鼠于注射百日咳毒素后当天精神、食欲稍差,其中D组8号豚鼠注射PT后右下肢运动能力明显减退,不能站立,根据Hartley豚鼠EAN模型评分标准,评分2级,放回笼中观察5min,运动能力明显好转,可站立,观察30min,运动能力恢复正常,评分0级。次日,实验组豚鼠精神、食欲恢复正常。实验组豚鼠于注射百日咳毒素后第二天灌喂空肠弯曲菌,E组6号豚鼠自灌喂结束后17天腹部出现皮毛较脏现象。其余实验组豚鼠未出现肢体活动障碍、皮毛较脏等异常现象;2神经病理观察:2.1锇酸染色观察:实验组豚鼠坐骨神经出现髓鞘脱失、断裂、聚集成块状,部分轴索被压迫,轴索粗细不等,愞飞氏结处板层疏松,结旁区皱缩呈城墙样改变,愞飞氏结处虫蚀样改变,愞飞氏结增宽。对照组豚鼠坐骨神经愞飞氏结无增宽,髓鞘、轴索光滑。2.2实验组HE染色观察:轴索粗细不等,部分轴索断裂,髓鞘呈大小不一、程度不等的空泡样变。2.3实验组Gomori染色观察:部分轴索断裂、粗细不等,髓鞘呈不同程度、不同部位的空泡样变;3锇酸染色后各组周围神经病变率的统计结果:各组Hartley豚鼠周围神经纤维病变率如下:A(0.1μg)组为12.5%,B(1μg)组为22.5%,C(2μg)组为23%,D(10μg)组为19.5%,E(20μg)组为22%,F(0μg)组为2.5%。采用SPSS 13.0统计软件包进行统计分析,采用χ2分割法对各组之间的周围神经纤维病变数进行双侧性显著检验,校正检验水准,α的校正值为0.0033,得出F组与A~E各组之间均有统计学差异,A~E各组之间无统计学差异。采用χ2检验对各组组内豚鼠坐骨神经纤维的病变数进行双侧性显著检验,检验水准取α=0.05,得出各组活体取材和灌注后取材周围神经纤维病变率无统计学差异。结论:1空肠弯曲菌联合百日咳毒素可以导致Hartley豚鼠周围神经的损伤。2 0.1μg~20μg范围的百日咳毒素用量与Hartley豚鼠的周围神经纤维病变率没有剂量依赖关系。第二部分:灌喂频率的改变对Cj致Hartley豚鼠周围神经病模型的影响观察目的:探索空肠弯曲菌致Hartley豚鼠周围神经病模型的最佳灌喂频率,改良造模方案。方法:1制备菌悬液:从空肠弯曲菌菌株库中选取lulei株作为实验菌株,用哥伦比亚血培养基于42℃,10%CO2、5%O2、85%N2条件培养空肠弯曲菌。纯化菌种,制备3×108cfu/ml菌悬液。2实验方法:将32只SPF级4周龄Hartley豚鼠随机分为2组实验组和1组对照组,实验组每组12只,对照组8只。实验组分为:A组:每隔2天攻毒一次,连续攻毒7次,攻毒后每5天解剖3只。B组:每隔1天攻毒一次,连续攻毒10次,攻毒后每5天解剖3只。攻毒方法为空肠弯曲菌lulei株3×108cfu/ml菌悬液口服灌喂豚鼠,2ml/只,灌喂前Hartley豚鼠禁食15小时,禁水3小时,灌喂后半小时给食水。对照组C组为空白对照,分批次与实验组同期解剖,每批解剖2只。3实验动物临床症状、病理观察及统计分析:自灌喂当日起每日观察豚鼠的肢体活动、饮食、体重、皮毛、大便的情况(豚鼠的瘫痪评分评分标准参考第一部分中文摘要方法5)。于攻毒后按时间点解剖取材,取坐骨神经进行锇酸染色,每只豚鼠随机分离100根神经单丝,观察豚鼠的周围神经纤维病变情况,统计每组豚鼠周围神经纤维病变数,计算周围神经纤维病变率(周围神经纤维病变率=病变神经单根纤维数/100×100%)。采用χ2分割法对各组之间以及各组组内不同解剖批次之间的周围神经纤维病变率进行统计学差异分析。结果:1豚鼠的临床症状:对照组豚鼠在整个实验过程中精神、饮食均可,且未出现肢体活动障碍现象及脱毛、皮毛较脏等异常现象。实验组豚鼠在整个实验过程中精神、饮食均可,肢体活动自如,其中B组16号、79号豚鼠于末次攻毒后5天出现脱毛现象,79号豚鼠于攻毒结束后18天皮毛恢复正常,16号豚鼠至解剖日皮毛未恢复正常;2神经病理观察:2.1锇酸染色:实验组豚鼠坐骨神经纤维出现髓鞘断裂聚集成块状,部分轴索被压迫,愞飞氏结结旁区皱缩呈城墙样改变,愞飞氏结处虫蚀样改变。对照组豚鼠坐骨神经纤维愞飞氏结无增宽,髓鞘、轴索光滑。2.2锇酸染色后各组周围神经病变率的统计结果:A组为24.17%,B组为25.83%,C组为3.125%。各组组内四个解剖批次的周围神经病变率的统计结果:A1为19.33%,A2为25.67%,A3为26.67%,A4为25.00%,B1为21.33%,B2为25.00%,B3为26.67%,B4为30.33%,C1为3.5%,C2为2.5%,C3为3.0%,C4为3.5%。使用SPSS 13.0统计软件包进行统计分析,采用χ2分割法分别对A、B、C三组组间的神经病变情况进行双侧性显著检验,α的校正值为0.0167,得出A、B组均与C组存在统计学差异,A组和B组之间的无统计学差异;对每组组内各解剖批次的神经纤维病变情况进行双侧性显著检验,α的校正值为0.0083,得出A组、B组、C组各解剖批次之间均无统计学差异。结论:1消化道接触空肠弯曲菌的频率由每隔2天一次,持续7次增加到每隔1天一次,持续10次不能提高豚鼠的周围神经发病率。2自攻毒结束后20天内四个解剖时间点的豚鼠周围神经纤维发病率没有统计学差异。3机体的免疫状态相对于空肠弯曲菌的接触频率对机体发病情况的影响更为重要。
【关键词】：百日咳毒素 空肠弯曲菌 Hartley豚鼠 周围神经病 剂量效应关系 灌喂频率 空肠弯曲菌 Hartley豚鼠 周围神经病 动物模型
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R745;R-332
【目录】：

• 中文摘要5-10
• 英文摘要10-15
• 英文缩写15-17
• 引言17-18
• 第一部分 0.1μg～20μg范围的百日咳毒素与Cj致Hartley豚鼠周围神经纤维病变率没有剂量依赖关系18-50
• 前言18-19
• 材料与方法19-29
• 结果29-32
• 附图32-38
• 附表38-40
• 讨论40-45
• 小结45-46
• 参考文献46-50
• 第二部分 灌喂频率的改变对Cj致Hartley豚鼠周围神经病模型的影响观察50-66
• 前言50-51
• 材料与方法51-54
• 结果54-56
• 附图56-59
• 附表59-61
• 讨论61-63
• 小结63-64
• 参考文献64-66
• 结论66-67
• 综述 百日咳毒素在疾病动物模型中的研究现状及应用67-76
• 参考文献72-76
• 致谢76-77
• 个人简历77

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 徐飞;邢丛丛;陈扬;李震中;白欣立;;吉兰-巴雷综合征空肠弯曲菌感染诱导巴马小型猪致周围神经病动物模型的建立[J];脑与神经疾病杂志;2012年02期

2 钟玉霞;葛睿;吴丽媛;戴钰;张学军;;CD24分子调节百日咳毒素诱导小鼠急性肝损伤的实验研究[J];中国免疫学杂志;2011年05期

3 杨瑜;朱为;;百日咳毒素在疫苗中的研究现状及应用[J];国际生物制品学杂志;2007年04期

  本文关键词：Cj致Hartley豚鼠周围神经病模型—百日咳毒素剂量范围及灌喂频率的探索性研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：322256