抗金黄色葡萄球菌α-溶血素全人源单链抗体的筛选及初步鉴定
发布时间：2021-06-25 23:28
目的:从全人源单链抗体文库中筛选并鉴定抗金黄色葡萄球菌α-溶血素（α-HL）单链抗体。方法:IPTG低温诱导α-HL融合蛋白表达并纯化鉴定;采用噬菌体展示技术从单链抗体文库中筛选抗α-HL全人源单链抗体（sc Fv）。将筛选并测序鉴定正确的15株sc Fvs插入p LZ16载体进行表达验证和ELISA鉴定。结果:表达纯化的α-HL融合蛋白为可溶性蛋白,大小约为90 k D。采用表达的α-HL融合蛋白作为抗原,经过4轮噬菌体展示筛选,ELISA结果显示大约有34%的sc Fvs与α-HL具有结合特性。将与α-HL结合良好且序列正确的15株sc Fvs插入p LZ16载体中进行可溶性表达后,经Western blot验证正确; ELISA鉴定结果显示:sc Fvs与购买的α-HL（Sigma,USA）、金黄色葡萄球菌都具有较高的结合活性且对金黄色葡萄球菌特异,与白色葡萄球菌无交叉反应。结论:成功筛选到抗α-HL全人源单链抗体。
【文章来源】：中国免疫学杂志. 2019,35(09)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
SDS-PAGE电泳分析纯化后的α-HL融合蛋白Fig．1Analysisofpurifiedα-HLfusionproteinby
1α-HL融合蛋白的纯化及鉴定P-ColdTF融合表达载体携带有氨苄青霉素(Ampicillin)抗性基因，所以用Amp作为抗性筛选目的蛋白，并且P-ColdTF融合表达载体携带有多聚组氨酸标签(His-Tag)，因此利用Ni-NTA亲和纯化系统中nickel-IMACresin对His-Tag的结合特性进行纯化。蛋白表达并纯化完成后，经SDS-PAGE电泳检测，结果显示:成功纯化出单一的目的蛋白，其大小为90kD(图1)，其中载体上的TF分子伴侣大小为48kD，主要用于增加蛋白表达的可溶性。采用免疫蛋白印迹法Westernblot鉴定蛋白，证明表达纯化的蛋白即为目的蛋白α-HL(图2)。2.2抗α-HL全人源单链抗体的筛选将纯化的α-HL融合蛋白生物素化，并将其作为抗原，采用免疫磁珠法对天然全人源单链抗体文库进行4轮噬菌体展示富集，从富集4轮后的单链抗体文库中随机挑取克隆子，采用phage-ELISA法进行抗原抗体结合鉴定。结果显示:经4轮噬菌体展示筛选后，特异性单链抗体得到富集。随机挑取的1000余个克隆子进行ELISA初筛，取2个不包被抗原的酶标孔作为阴性对照。结果显示，阴性对照OD450值为0.05左右，部分克隆子与抗原有结合反应，其中OD450＞0.8图1SDS-PAGE电泳分析纯化后的α-HL融合蛋白Fig．1Analysisofpurifiedα-HLfusionproteinbySDS-PAGENote:Marker.Proteinmolecularweightmarker;Lanes1－3.Expressedproteinofα-HLfusionprotein.的阳性单链抗体占34%左右，图3为采用ELISA筛选出的部分克隆子。2.3单链抗体的测序鉴定将OD450值最高的18株单链抗体进行大量表达后提取质粒测序，测序结果表明:其中15株单链抗体测序序列为开放阅读图2免疫印迹法验证α-HL融合蛋白Fig．2Identificationofα-HLfusionproteinbyWesternblotNote:Marker.BenchMarkTMPre-Stained
roteinbySDS-PAGENote:Marker.Proteinmolecularweightmarker;Lanes1－3.Expressedproteinofα-HLfusionprotein.的阳性单链抗体占34%左右，图3为采用ELISA筛选出的部分克隆子。2.3单链抗体的测序鉴定将OD450值最高的18株单链抗体进行大量表达后提取质粒测序，测序结果表明:其中15株单链抗体测序序列为开放阅读图2免疫印迹法验证α-HL融合蛋白Fig．2Identificationofα-HLfusionproteinbyWesternblotNote:Marker.BenchMarkTMPre-StainedProteinLadder;Lanes1－3.Expressedproteinofα-HLfusionprotein.图3ELISA初筛抗α-HL全人源单链抗体Fig．3PreliminaryselectionofscFvsagainstα-HLbyELISANote:1－82.Numberofdifferentclones.Theabsorbance(A)readingat450nmwastakenastheresult.ThenegativecontrolwasaboutOD450=0.05.图4抗α-HL全人源单链抗体条状结构图Fig．4Ｒibbondiagramofanti-α-HLpositivescFv(scFv777)Note:Variableregions(bothVHandVL)wereshowninyellow.·2011·中国免疫学杂志2019年第35卷
本文编号：3250158
【文章来源】：中国免疫学杂志. 2019,35(09)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
SDS-PAGE电泳分析纯化后的α-HL融合蛋白Fig．1Analysisofpurifiedα-HLfusionproteinby
1α-HL融合蛋白的纯化及鉴定P-ColdTF融合表达载体携带有氨苄青霉素(Ampicillin)抗性基因，所以用Amp作为抗性筛选目的蛋白，并且P-ColdTF融合表达载体携带有多聚组氨酸标签(His-Tag)，因此利用Ni-NTA亲和纯化系统中nickel-IMACresin对His-Tag的结合特性进行纯化。蛋白表达并纯化完成后，经SDS-PAGE电泳检测，结果显示:成功纯化出单一的目的蛋白，其大小为90kD(图1)，其中载体上的TF分子伴侣大小为48kD，主要用于增加蛋白表达的可溶性。采用免疫蛋白印迹法Westernblot鉴定蛋白，证明表达纯化的蛋白即为目的蛋白α-HL(图2)。2.2抗α-HL全人源单链抗体的筛选将纯化的α-HL融合蛋白生物素化，并将其作为抗原，采用免疫磁珠法对天然全人源单链抗体文库进行4轮噬菌体展示富集，从富集4轮后的单链抗体文库中随机挑取克隆子，采用phage-ELISA法进行抗原抗体结合鉴定。结果显示:经4轮噬菌体展示筛选后，特异性单链抗体得到富集。随机挑取的1000余个克隆子进行ELISA初筛，取2个不包被抗原的酶标孔作为阴性对照。结果显示，阴性对照OD450值为0.05左右，部分克隆子与抗原有结合反应，其中OD450＞0.8图1SDS-PAGE电泳分析纯化后的α-HL融合蛋白Fig．1Analysisofpurifiedα-HLfusionproteinbySDS-PAGENote:Marker.Proteinmolecularweightmarker;Lanes1－3.Expressedproteinofα-HLfusionprotein.的阳性单链抗体占34%左右，图3为采用ELISA筛选出的部分克隆子。2.3单链抗体的测序鉴定将OD450值最高的18株单链抗体进行大量表达后提取质粒测序，测序结果表明:其中15株单链抗体测序序列为开放阅读图2免疫印迹法验证α-HL融合蛋白Fig．2Identificationofα-HLfusionproteinbyWesternblotNote:Marker.BenchMarkTMPre-Stained
roteinbySDS-PAGENote:Marker.Proteinmolecularweightmarker;Lanes1－3.Expressedproteinofα-HLfusionprotein.的阳性单链抗体占34%左右，图3为采用ELISA筛选出的部分克隆子。2.3单链抗体的测序鉴定将OD450值最高的18株单链抗体进行大量表达后提取质粒测序，测序结果表明:其中15株单链抗体测序序列为开放阅读图2免疫印迹法验证α-HL融合蛋白Fig．2Identificationofα-HLfusionproteinbyWesternblotNote:Marker.BenchMarkTMPre-StainedProteinLadder;Lanes1－3.Expressedproteinofα-HLfusionprotein.图3ELISA初筛抗α-HL全人源单链抗体Fig．3PreliminaryselectionofscFvsagainstα-HLbyELISANote:1－82.Numberofdifferentclones.Theabsorbance(A)readingat450nmwastakenastheresult.ThenegativecontrolwasaboutOD450=0.05.图4抗α-HL全人源单链抗体条状结构图Fig．4Ｒibbondiagramofanti-α-HLpositivescFv(scFv777)Note:Variableregions(bothVHandVL)wereshowninyellow.·2011·中国免疫学杂志2019年第35卷
本文编号：3250158
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