针对Pleiotrophin的siRNA抑制PTEN～（-/-）细胞恶性表型的研究

发布时间：2021-06-25 20:05

　　目的:Pleiotrophin （Ptn,多效生长因子）是一种分泌性生长因子,具有促进肿瘤细胞增殖与迁移及肿瘤血管生成等功能。本研究旨在通过设计一种能够有效抑制该基因表达的小干扰RNA,以遏制Pten^-/-细胞的恶性表型,从而达到抑制肿瘤发生与发展的目的。方法:（1）设计并合成具有基因特异性的一组寡核苷酸片段,克隆到pSilencerTM 3.1-H1 hygro载体;（2）瞬时转染siRNA表达载体至3T3细胞,以检测不同siRNA对Ptn基因表达的抑制能力;（3）用脂质体Lipofectamine 2000转染和潮霉素筛选等方法建立能稳定表达相应Ptn siRNAs的一组Pten^-/- MEF241细胞株,并对其Ptn表达水平进行检测;（4）利用细胞生长曲线、Western blot检测沉默Ptn基因对Pten^-/-MEF241细胞生长和信号转导的影响;（5）裸鼠成瘤实验观察Ptn基因沉默后,Pten^-/-MEF241细胞致瘤的特性。结果:设计并合成了3条针对Ptn基因的siRNAs,并证实其中... 

【文章来源】：重庆医科大学重庆市

【文章页数】：61 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

PsilencerTM3.0-H1hygro表达载体结构示意图

图 1-2：退火后的发夹状的 siRNAFigure1-2:Annealed hairpin siRNA template insert（3）酶切：将 pSilenceTM3.1 hygro 载体进行 BamHⅠ 和 Hind Ⅲ 双酶切，酶切后将产物进行乙醇沉淀纯化回收。估计 DNA 溶液的体积，加入 1/9 体积浓度为3M Ph5.2 的 NaAc，充分混匀。加入两倍体积的冰冷乙醇，充分混匀；冰浴 15-30分钟；以 13000rpm/min 以上转速 0℃ 离心 10 分钟，弃上清；沉淀 DNA 中加入1ml 70%乙醇，以 13000rpm/min 以上转速 0℃ 离心 2 分钟；小心吸出上清，并将上清保留，所剩固体为 DNA ；室温挥发，重溶测浓度。(4)连接： 将退火后的 siRNA A, siRNA B, siRNA C 双链 DNA 与酶切纯化后的pSilencerTM3.1 质粒连接。取 5ul 退火产物加入 45 ul 无菌水，使其终浓度为8ng/ul 。管中加入下述各物:Plus-insert Minus-insert Component1ul _ 稀释的退火后 siRNA insert

（7）放射自显影：将洗干净含有目的 RNA 的膜有 RNA 的面朝上。-70℃放射自显影 48-72 小时洗去探针，（90-100 H2O/0.5%SDS）洗膜 10 分钟保鲜膜包裹保存。2 结果与讨论2.1 结 果2.1.1 根据 Ambion 公司的 siRNA 设计原采用小干扰 RNA （siRNA）技术沉默 Pleiot小鼠 Pleiotrophin 基因的 siRNA 的寡核苷酸构建载体。其编码的 siRNA 见图 1-3。


本文编号：3249867