人类心肌α-actin启动子真核表达载体的构建及在ES细胞中的初步应用

发布时间：2021-07-06 04:30

　　心肌坏死导致心肌细胞死亡，进一步导致心衰、心肌重构等。由于成年化的心肌细胞不能分裂，寻找可替代死亡心肌细胞的移植物来治疗心肌坏死是近年来研究的热点。胚胎干细胞具有多分化潜能，适宜条件下可分化为多种细胞，从而构成机体的不同器官与组织。利用 ES 细胞的分化潜能和定向分化的可调性，将胚胎干细胞诱导分化为心肌细胞，可以作为心肌细胞移植治疗的细胞来源。但是，对这种来源的心肌细胞要求很高纯度，因为全能干细胞移植到个体可能会导致畸胎瘤。研究表明，通过基因操作可以从分化的 ES 细胞中纯化获得所需的心肌细胞。 α-actin 是心脏发生的最早标志，在 ES 细胞分化为自发收缩的心肌细胞之前特异性表达，指导其组织特异性表达的是α-actin 基因启动子。对这一启动子的研究，不仅可间接研究心肌发育过程，更重要的是可以用来做调控序列纯化 ES 细胞源心肌细胞作移植治疗。本实验的目的旨在构建出含人类心肌α-actin 启动子的真核表达载体，用来转染小鼠 ES 细胞，纯化和进一步研究 ES 细胞源心肌细胞。我们用 PCR 法直接从全基因组中扩增人类心肌α-actin 基因的启动子片段，连接到 pMD-18T... 

【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：57 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
文献综述 胚胎干细胞分化的研究进展及其与心肌损伤性疾病的治疗
    1 胚胎干细胞的生物学特征
        1.1 ES 细胞的形态学特征
        1.2 ES 细胞的高度分化潜能
        1.3 ES 细胞的分子标记
        1.4 ES 细胞显著区别于其他细胞系的几大特征
    2 胚胎干细胞定向分化的研究进展
        2.1 胚胎干细胞诱导分化的一般方法
            2.1.1 细胞因子诱导法
            2.1.2 选择性标记基因筛选目的细胞法
            2.1.3 特异性转录因子异位表达法
            2.1.4 药物及化学试剂诱导法
        2.2 胚胎干细胞诱导分化研究概况
            2.2.1 心肌细胞
            2.2.2 神经细胞
            2.2.3 造血细胞
            2.2.4 血管和内皮细胞
            2.2.5 胰岛素分泌细胞
            2.2.6 脂肪细胞
            2.2.7 向其他细胞和组织定向分化
    3 胚胎干细胞体外定向诱导分化研究存在的问题
        3.1 诱导 ES 细胞向某一特定类型细胞分化的技术尚不成熟
        3.2 建立无血清培养诱导体系
        3.3 特定分化细胞的扩增
        3.4 分化细胞应用于移植治疗的免疫排斥问题
        3.5 分化细胞应用于移植治疗的安全性问题
    4 胚胎干细胞诱导分化研究展望
    5 胚胎干细胞与心肌损伤性疾病的治疗
实验研究
    实验一 人类心肌 Α-ACTIN 启动子基因的克隆
        1 材料
            1.1 主要仪器设备
            1.2 酶及主要试剂
            1.3 实验动物及菌株
        2 方法
            2.1 人流产胎儿心肌总 DNA 的提取
            2.2 人类心肌 Α-ACTIN 启动子基因的 PCR 扩增
                2.2.1 引物的设计与合成
                2.2.2 人类心肌 α-actin 启动子基因的 PCR 扩增
            2.3 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳、回收
                2.3.1 琼脂糖凝胶电泳
                2.3.2 PCR 电泳产物的回收
            2.4 人类心肌 Α-ACTIN 启动子基因的克隆
                2.4.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
                2.4.2 pMD18-T-α-actin-P 的构建
            2.5 阳性重组质粒的筛选及鉴定
                2.5.1 碱裂解法提取质粒 DNA
                2.5.2 酶切鉴定
            2.6 测序
        3 结果
            3.1 目的基因的扩增:
            3.2 回收后电泳结果
            3.3 目的基因的 TA 克隆和筛选
            3.4 测序结果
        4 讨论
    实验二 含人类心肌 Α-ACTIN 启动子真核表达载体的构建及其应用
        1 材料
            1.1 质粒
            1.2 试剂
            1.3 主要仪器设备
            1.4 细胞培养液
            1.5 小鼠胚胎干细胞
        2 方法
            2.1 人类 Α-ACTIN 启动子真核表达载体的构建
                2.1.1 pEGFP-N1 中巨细胞病毒启动子的去除
                2.1.2 人类 α-actin 启动子真核表达载体 pEGFP-N1-α-actin-P 的构建
            2.2 含有人类 Α-ACTIN 启动子的 PEGFP-N1-Α-ACTIN-P 质粒纯化
            2.3 小鼠胚胎干细胞的制备
                2.3.1 小鼠成纤维细胞的分离与纯化
                2.3.2 小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备
                2.3.3 小鼠胚胎干细胞的培养和增殖
            2.4 转染细胞的筛选与增殖
                2.4.1 转染
                2.4.2 转染细胞的筛选与增殖
                2.4.3 转染细胞的免疫组化检测
        3 结果
            3.1 人类 Α-ACTIN 启动子真核表达载体的构建
            3.2 小鼠 ES 细胞的转染与筛选
            3.3 免疫组化结果
        4 讨论
            4.1 真核表达载体的构建
            4.2 小鼠 ES 细胞的转染和筛选
            4.3 PEGFP-N1-Α-ACTIN-P 重组质粒在小鼠 ES 细胞中的表达
        5 实验中存在的问题
结 论
参考文献
致谢
作者简介



本文编号：3267527