副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因的克

发布时间：2021-07-12 06:05

　　研究背景：副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus，Vp）是一种嗜盐性弧菌，可引起食物中毒、反应性关节炎和心脏疾病，副溶血弧菌引起的食物中毒在细菌性食物中毒占的比例很高，发病呈世界性分布，并呈上升趋势，我国沿海地区每年都有因副溶血弧菌引起食物中毒的报道。目前研究认为副溶血弧菌的主要致病因子是其产生的多种溶血毒素，不耐热溶血毒素（thermolabile hemolysin，TLH）是其产生的毒素之一，研究表明副溶血弧菌无论是临床分离株，还是环境分离株都含有tlh基因，且具有种属特异性，国外研究利用tlh基因对副溶血弧菌进行监测和检测，但对其功能和致病性研究的相对较少，国内未见相关研究报道，目前对TLH的功能和致病性仍不清楚。 研究目的；本研究旨在利用编码TLH毒素的tlh基因在副溶血弧菌存在的广泛性和种属特异性，克隆tlh基因，构建原核融合表达载体，纯化获得具有生物活性功能的TLH，对其功能、致病性和免疫原性等方面进行研究。 研究方法： 1．以副溶血弧菌国内标准株Vp14-90基因组DNA为模板，扩增tlh基因，构建克隆载体pGEM-tlh，酶切及P... 

【文章来源】：南方医科大学广东省

【文章页数】：92 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
缩略词表
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分 副溶血弧菌不耐热溶血毒素tlh基因的体外扩增、克隆及序列分析
    材料与方法
        一、 材料
        二、 实验方法
            (一) 引物的设计与合成
            (二) VP14-90基因组DNA的提取
            (三) tlh基因高保真扩增
            (四) PCR产物加A反应
            (五) 目的基因tlh的纯化回收
            (六) tlh基因克隆
            (七) 重组克隆的筛选与鉴定
            (八) tlh基因的序列测定及同源性分析
            (九) tlh14-90基因的生物信息学分析
    结果
        一、 tlh14-90基因的扩增
        二、 pGEM-tlh重组质粒的筛选和鉴定
        三、 tlh14-90基因测序结果
        四、 tlh14-90基因的生物信息学分析
    讨论
    小结
第二部分 副溶血弧菌不耐热溶血毒素重组表达质粒的构建及鉴定
    材料与方法
        一、 材料
        二、 实验方法
            (一) 目的基因tlh14-90片断的获得
            (二) pET32a+质粒DNA的提取、限制性内切酶消化及纯化回收
            (三) 表达载体的构建
            (四) 重组质粒的筛选和鉴定
            (五) 免疫印迹(Western-blot)检测目的蛋白的表达
    结果
        一、 重组表达载体pET32a-tlh的酶切及PCR鉴定
        二、 阳性重组克隆(pET32a-tlh/DE3)的诱导表达鉴定
        三、 免疫印迹(Western-blot)检测结果
    讨论
    小结
第三部分 重组蛋白的表达与纯化
    材料与方法
        一、 材料
        二、 实验方法
            (一) 表达产物可溶性的确定
            (二) tlh14-90基因在大肠杆菌中的表达及SDS-PAGE分析
            (三) 表达产物的纯化
    结果
        一、 tlh14-90基因在大肠杆菌中的表达及可溶性
        二、 表达条件的优化
        三、 表达蛋白的纯化
    讨论
    小结
第四部分 副溶血弧菌不耐热毒素的复性、免疫原性及功能的研究
    材料与方法
        一、 材料
        二、 实验方法
            (一) 纯化蛋白的复性
            (二) 功能研究
            (三) 免疫原性的研究
    结果
        一、 复性结果
        二、 复性蛋白TLH14-90的功能研究
            (一) 溶血功能
            (二) 兔肠结扎实验
            (三) 兔肠病理改变结果
            (四) 耐热实验
            (五) 免疫原性的研究
            (六) 保护性抗原作用
            (七) 溶血抑制实验
    讨论
    小结
参考文献
致谢
综述
附录1: tlh14-90 GeneBank收录结果
附录2: TLH14-90 GeneBank收录结果
附录3: 硕士期间论文发表情况


【参考文献】：
期刊论文
[1]人重组载脂蛋白E在大肠杆菌中的表达和纯化[J]. 国汉邦,董军,王抒.  中国动脉硬化杂志. 2002(05)
[2]应用地高辛标记的寡聚核酸探针检测副溶血弧菌[J]. 蒋鲁岩,陈光哲,祝长青,秦敏,张常印.  检验检疫科学. 2002(04)
[3]副溶血弧菌的致病性及其检验和测定[J]. 乔华林,章俊.  水产科学. 1999(04)
[4]合成特异性寡核苷酸探针检测KP阳性副溶血弧菌[J]. 王保龙,黄尊波.  中华医学检验杂志. 1994(05)
[5]大肠杆菌肠毒素的研究[J]. 林成水,曾凝梅,叶荣华,郑金凤,郭维植.  微生物学通报. 1984(02)



本文编号：3279361