应用COI基因对我国旋毛虫四个地理株的鉴定及虫体抗原的免疫组分分析

发布时间：2017-04-26 18:09

  本文关键词：应用COI基因对我国旋毛虫四个地理株的鉴定及虫体抗原的免疫组分分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：旋毛虫病(Trichinellosis)是一种因食用生的或未煮熟肉类感染旋毛虫而引起的重要人畜共患寄生虫病。我国存在旋毛形线虫(T. spiral is)和乡土旋毛虫(T. native),其中旋毛形线虫是引起人体旋毛虫病的主要病原体。因感染的旋毛虫虫种不同、摄入虫体的量、感染程度及个体的免疫反应不同,旋毛虫病患者表现出不同的症状：如腹泻、恶心、发热、乏力,眶周浮肿、弥漫性肌痛、瘫痪样症状,甚至脑炎、心肌炎,其中心肌炎是导致病人死亡最主要的原因。因旋毛虫病临床症状的非特异性,其确诊常通过实验室辅助检查。活组织检查作为旋毛虫病的诊断金标准被国际旋毛虫病委员会推荐使用,但这种方法是损伤性检查,病人依从性低。该方法在畜牧业和屠宰业中使用较广,常因为感染早期假阴性率高、受取材部位、感染程度影响所致假阴性等导致漏诊。目前用于检测抗旋毛虫抗体的血清学方法以ELISA的敏感性最高,具有经济、检测方法标准化、特异性和敏感性比较稳定以及检测结果可信度高等优点,已被国际旋毛虫病委员会列为推荐应用的方法。旋毛虫病有效抗原成分的研究是免疫诊断研究的基础,本研究以旋毛虫云南地理株、湖北地理株、河南地理株和东北地理株为材料,通过酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)和免疫印迹分析(Western blot, WB)对各地理株的虫体抗原和排泄-分泌抗原进行研究,以期了解不同地理株抗原组分及免疫效果的差异。本研究以4个旋毛虫地理株为研究材料,以旋毛虫感染昆明小鼠(约500条／只)建立动物模型,感染后45 d解剖小鼠,通过人工消化法获得旋毛虫肌幼虫。对获得的虫体进行形态学观察,并用线粒体细胞色素氧化酶工基因(cytochrome c oxidase subunit I gene,COI)进行虫种鉴定。体外培养收集排泄-分泌抗原(excretory-secretory antigens, ESA),以冻融匀浆法制备虫体抗原(crude muscle larvae antigens, CLA)。通过ELISA试验观察不同地区来源旋毛虫肌幼虫抗原的敏感性、特异性及其与其他寄生虫感染血清的交叉反应。以聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)和免疫印迹法分析虫体抗原和排泄-分泌抗原的组分及有效免疫反应组分。结果,各地理株获得虫体均达40 000条,包囊在显微镜下呈梭形,虫体卷曲状,洗涤后虫体呈“C”形或卷曲运动,表皮光滑,两端钝圆,无突起和附器,杆状体约占虫体前2/3。4个旋毛虫地理株COI基因扩增产物均在约400bp处出现明显条带,序列测定并拼接后,云南株380bp、湖北株380bp、河南株380bp、东北株380bp,经BLAST与旋毛虫ISS413株AF129486.1基因比对,同源性均为99%,在第269位存在一个T-C转位位点；4个虫株该部分序列相似性为100%,均与旋毛形线虫亲缘关系较近,可能是同一虫种。以制备的4个地理株虫体抗原和排泄-分泌抗原进行ELISA试验,检测旋毛虫病患者血清敏感性100%,特异性100%。与血吸虫病、棘球蚴虫病、囊尾蚴病患者血清存在交叉反应,与华支睾吸虫病、裂头蚴病、钩虫病患者血清未见交叉反应。虫体抗原与血吸虫病人血清反应中,湖北地理株阳性率2.85%,东北地理株阳性率11.4%；虫体抗原与棘球蚴病人血清反应中,云南地理株阳性率11.7%,河南地理株阳性率5.8%；虫体抗原与囊尾蚴病人血清反应中,云南地理株阳性率为12%,湖北地理株阳性率16%,河南地理株阳性率32%,东北地理株阳性率12%。排泄-分泌抗原与血吸虫病人血清反应中,云南地理株阳性率2.85%,东北地理株阳性率11%；与囊尾蚴病人血清反应中,云南地理株阳性率为12%,湖北地理株阳性率8%,河南地理株阳性率24%,东北地理株阳性率12%。SDS-PAGE分析4个旋毛虫地理株虫体可溶性抗原抗原条带分子量范围为100000-10000,均含有8条主带,Mr为100000、66000、49000、45000、43000、30000、18000、12000；3条次带,Mr为82000、80000、53000。排泄-分泌抗原Mr范围为70000～10000,有8条主带,Mr为66000、53000、49000、43000、40000、34000、30000、16000。Western blot分析结果显示,旋毛虫肌幼虫虫体可溶性抗原可与旋毛虫病患者和感染小鼠血清的反应,条带以Mr95000、72000、53000、49000、43000为主,排泄-分泌抗原反应条带以Mr 53000、49000、43000、40000为主。云南地理株虫体抗原与血吸虫病患者、裂头蚴病患者、鞭虫病患者、囊尾蚴病患者、钩虫病患者血清在Mr约95000处有可疑阳性反应条带。东北地理株排泄-分泌抗原与卫氏并殖吸虫病患者、囊尾蚴病患者血清在Mr约45 000处可见可疑反应条带。综上所述,4个旋毛虫地理株经COI基因检测,鉴定为同一虫种。制备各地理株虫体可溶性抗原和排泄-分泌抗原,建立的ELISA方法对于旋毛虫病的诊断具有较好的效果,SDS-PAGE 和 Western blot分析发现肌幼虫虫体可溶性抗原的95 000、72 000成分和排泄-分泌抗原的40 000成分可作为进一步研究的重点,为后续研究提供参考。
【关键词】：旋毛虫 肌幼虫 COI ELISA Western blot
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 中英文全称及缩写对照4-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 前言11-17
• 技术路线17-18
• 第一部分 应用COI基因鉴定四个旋毛虫地理株虫种18-28
• 引言18
• 1. 材料与方法18-21
• 2. 结果21-26
• 3. 讨论26-28
• 第二部分 四个旋毛虫地理株肌幼虫虫体蛋白和排泌蛋白的免疫诊断学效果观察28-39
• 引言28
• 1. 材料与方法28-31
• 2. 结果31-37
• 2.1 获得4个旋毛虫地理株不同抗原浓度31-34
• 2.2 不同抗原做ELISA免疫检测的效果34-37
• 3. 讨论37-39
• 第三部分 四个旋毛虫地理株肌幼虫虫体抗原的蛋白组分和免疫抗原组分分析39-47
• 引言39
• 1. 材料与方法39-42
• 2. 结果42-45
• 3. 讨论45-47
• 第四部分 四个旋毛虫地理株肌幼虫排泄-分泌抗原的蛋白组分和免疫组分分析47-54
• 引言47
• 1. 材料与方法47-50
• 2. 结果50-53
• 3. 讨论53-54
• 全文小结54-56
• 参考文献56-59
• 附图59-61
• 致谢61-63
• 附录163-64
• 附件64-69
• 综述69-72

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本文编号：328965