布鲁氏菌S2株L7/L12蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

发布时间：2021-07-19 20:17

　　目的用大肠埃希菌表达布鲁氏菌S2株L7/L12蛋白,制备其多克隆抗体。方法设计引物,以S2弱毒株DNA基因组为模板扩增目的基因片段L7/L12,构建pET28a-L7/L12质粒并转化入E.coli BL21（DE3）,IPTG诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE检测表达蛋白的可溶性及其分子质量;金属亲和层析法纯化目的蛋白,BCA法对纯化蛋白定量。将rL7/L12蛋白与弗氏完全佐剂混合（终浓度为0.5mg/ml）,每次1ml分两次间隔21d免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。免疫结束后12d,颈静脉采血,分离血清,采用间接ELISA法检测血清抗体效价。以免疫血清1∶200倍稀释作为一抗,采用Western blot分析其与r-L7/L12、布鲁氏菌S2株全菌体蛋白及大肠埃希菌DH5α全菌体蛋白结合的特异性。结果经测序与酶切鉴定,成功构建表达载体pET28a-L7/L12,SDS-PAGA分析表达产物部分为可溶性,分子质量单位约为14ku;SDS-PAGE分析亲和纯化蛋白为单一条带,蛋白质含量为0.8mg/ml。间接ELISA检测免疫血清抗体效价为1∶12 800,该抗体能够与r-L7/L1... 

【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2014,9(12)北大核心CSCD

【文章页数】：4 页

【部分图文】：

图１Ｌ７／Ｌ１２基因ＰＣＲ产物０．８％琼脂糖凝胶电泳图ＭＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ１Ｌ７／Ｌ１２ｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎＦｉｇ．１Ｌ７／Ｌ１２ｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙＰＣＲ

２Ｔｈｅｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｏｆｉｎｔｒｕｄｕｃｅｄｂａｃｔｅｒｉａｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ３Ｔｈｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｏｆｉｎｔｒｕｄｕｃｅｄｂａｃｔｅｒｉａｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ４ＵｎｉｎｔｒｕｄｕｃｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａＭｐｒｏ－ｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｍａｒｋｅｒ５ＰｕｒｉｆｉｅｄＬ７／Ｌ１２Ｆｉｇ．３ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓＬ７／Ｌ１２ｂｙＳＤＳ－ＰＡＧＥ图４ｒ－Ｌ７／Ｌ１２蛋白免疫兔多克隆抗体效价Ｆｉｇ．４ｒＬ７／Ｌ１２ａｓｃｏａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｄｅｔｅｃｔｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｉｔｅｒ（ｘ±ｓ）·１０６９·中国病原生物学杂志ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｇｅｎＢｉｏｌｏｇｙ２０１４年１２月第９卷第１２期Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２０１４，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．１２

Ｍ蛋白分子质量标准１ｒＬ７／Ｌ１２蛋白与多克隆抗体反应条带２布鲁氏菌Ｓ２菌体裂解蛋白对照３大肠埃希菌菌体蛋白对照图５抗Ｌ７／Ｌ１２多克隆抗体Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析ＭＰｒｏｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｍａｒｋｅｒ１ｒＬ７／Ｌ１２２ＢｒｕｃｅｌｌａＳ２ｇｒｏｓｓｐｒｏｔｅｉｎｓ３Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）Ｆｉｇ．５Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｂｙｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ讨论每年全世界报告布鲁氏菌感染人间病例约５０００００例，受感染范围波及南美洲、亚洲、非洲及地中海地区，给人类造成巨大的损失，而接种疫苗可预防布鲁氏菌病的爆发流行［６］。当前布鲁氏菌的研究主要方向包括布鲁氏菌重要免疫抗原的研究［６］，与其致病相关联的Ⅳ型分泌系统研究［７］，在人体引起固有免疫应答的信号传导机制的研究［８］及其在人体适应性免疫应答过程中的逃逸机制研究［９］等。其中布鲁氏菌重要免疫抗原的研究一直是热点问题。Ｌ７／Ｌ１２是布鲁氏菌重要免疫抗原之一，属核糖体蛋白中的一员，参与布鲁氏菌蛋白质合成过程，结构保守，是良好的疫苗候选抗原蛋白［１０］。Ｔａｂｙｎｏｖ等［１１－１２］将Ｌ７／Ｌ１２蛋白与流感病毒载体结合包裹成类病毒颗粒作为疫苗抗原，免疫小鼠和豚鼠后发现该抗原可以作为疫苗预防Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ５４４株所引起的感染。Ｌｕｏ等［１３］报道Ｌ７／Ｌ１２作为布鲁氏菌疫苗抗原的机制之一是天然的Ｌ７／Ｌ１２蛋白内含Ｔ细胞表位，能够刺激机体产生Ｔｈ１类细胞免疫应答，通过分泌的ＩＦＮ－γ刺激巨噬

【参考文献】：
期刊论文
[1]我国布鲁氏菌感染的研究现状及展望[J]. 成岩,白靓,张树军.  内蒙古民族大学学报(自然科学版). 2012(03)



本文编号：3291358