丁酸盐对骨髓源树突状细胞的调控及机制研究

发布时间：2017-04-27 14:13

  本文关键词：丁酸盐对骨髓源树突状细胞的调控及机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:在人和动物的肠道内,丁酸盐(butyrate acid,Bu)作为最主要的短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFA)之一,是由食物中不消化的碳水化合物在肠腔内经厌氧菌酵解生成,与肠道内微生物群共同形成肠道区域微环境,并且参与肠道免疫稳态的维护。到目前为止,有关SCFA调节免疫细胞的分化、功能及机制方面尚缺乏研究,因此本研究观察了Bu对免疫系统的重要参与者-骨髓源树突状细胞和体外诱导性粘膜树突状细胞的调控作用。方法:1.丁酸盐对小鼠骨髓源树突状细胞的免疫调节作用(1)取骨髓细胞,破红,计数,铺入6孔板。(2)培养至第七天,计数,铺入24孔板,LPS刺激其成熟及Bu处理,观察形态。(3)流式检测骨髓源树突状细胞(bone marrow derived dendritic cells,BMDCs)表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ及B7-DC的表达情况。(4)Q-PCR检测BMDCs的IL-6、IL-12的m RNA水平表达情况。(5)格里斯反应(Griess reaction)检测细胞上清中NO的浓度。(6)流式检测BMDCs诱导CD8+T细胞增殖的能力。(7)提蛋白,Westernblot检测Bu处理各时间点(0min、15min、30min、60min)BMDCs中p-ERK的表达。2.丁酸盐对RA诱导的小鼠骨髓源粘膜树突状细胞分化及功能的影响(1)取骨髓细胞,破红,计数,铺入6孔板。(2)培养至第七天,第3天时加维甲酸(retinoic acid,RA)和丁酸盐(Bu)处理,第七天时计数,铺入24孔板,LPS刺激其成熟,观察形态。(3)流式检测CD11b+CD11c+DC群体数。(4)荧光示踪染料CFSE标记后培养至第七天,流式检测FSC、SSC及CFSE的变化。(5)流式检测CCR9、α4β7、CD103及CD80、CD86、MHC-Ⅱ、B7-DC的表达情况。(6)流式检测细胞醛脱氢酶(Aldehydedehydrogenase,ALDH)的活性。(7)Q-PCR检测细胞的IL-6、IL-12、TNF-α及Nos2的m RNA水平;ELISA检测上清中IL-12p70的含量。(8)流式检测各组DCs诱导CD4+T细胞增殖的能力。(9)流式检测各组DCs诱导Foxp3+Treg的能力。结果:(1)丁酸盐可明显下调成熟BMDCs表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ及B7-DC的表达,抑制细胞因子IL-6、IL-12及NO的分泌,并且抑制BMDCs对OVA257-264抗原特异性CD8+T细胞的增殖。Westernblot检测结果也显示丁酸盐抑制TLR4信号通路中ERK分子的磷酸化。(2)丁酸盐会显著下调粘膜DCs诱导过程中CD11c的表达,上调粘膜DCs表面CCR9、α4β7及CD103的表达,抑制粘膜DCs细胞ALDH的活性。经RA诱导的骨髓源粘膜DCs或是正常诱导的BMDCs其诱导CD4+T细胞增殖的能力均会受到丁酸盐的抑制,且正常诱导的BMDC所受的抑制更明显。另外,RA诱导的骨髓源粘膜DCs更能促进诱导Tregs的分化,而丁酸盐对其的抑制效应并不明显。结论:对于BMDCs细胞,丁酸盐可通过抑制TLR4信号通路中ERK分子磷酸化来下调BMDCs细胞的免疫功能;对于RA诱导的粘膜DCs细胞,丁酸盐可下调其CD11c的表达且抑制其ALDH活性,而明显上调其肠道归巢受体及CD103的表达来促进其向肠道的归巢,由此可见丁酸盐在粘膜DCs细胞回归肠道定居中起重要作用;丁酸盐对粘膜DCs诱导的抗原特异性T细胞增殖的抑制表明其可使T细胞呈现应答低反应性状态,对维持肠道免疫耐受发挥的重大作用;另外,RA对骨髓源DCs的诱导处理可明显上调Tregs的分化,然而丁酸盐的处理对粘膜DCs这一功能的影响并不明显。综上所述,丁酸盐可促进RA诱导的骨髓源粘膜DCs肠道归巢、免疫低应答性等特性的建立,因而能在维持肠道自稳方面发挥重要作用。
【关键词】：短链脂肪酸 丁酸盐 骨髓源树突状细胞 维甲酸 粘膜树突状细胞
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 英文缩写索引13-15
• 第一章 绪论15-25
• 1.1 丁酸盐15-19
• 1.1.1 丁酸盐的来源15
• 1.1.2 丁酸盐的功能15-18
• 1.1.3 丁酸盐的受体18-19
• 1.1.4 丁酸盐对树突状细胞调控的研究现状19
• 1.2 树突状细胞19-20
• 1.2.1 树突状细胞的分类19-20
• 1.2.2 树突状细胞的功能20
• 1.2.3 树突状细胞的表面分子20
• 1.3 肠道区域树突状细胞与肠道区域免疫稳态20-22
• 1.3.1 肠道区域免疫20-21
• 1.3.2 肠道区域树突状细胞的分类与表型21-22
• 1.3.3 肠道区域树突状细胞的功能22
• 1.4 本研究的目的、方案设计及意义22-25
• 1.4.1 研究目的22
• 1.4.2 研究方法22-23
• 1.4.3 实验设计23-24
• 1.4.4 研究意义24-25
• 第二章 丁酸盐对小鼠骨髓源树突状细胞的免疫调节作用25-39
• 2.1 实验材料25-27
• 2.1.1 实验动物与试剂25-26
• 2.1.2 主要溶液的配置26
• 2.1.3 仪器与耗材26-27
• 2.2 实验方法27-31
• 2.2.1 小鼠骨髓细胞的制备及骨髓源树突状细胞的体外诱导培养27
• 2.2.2 细胞表面分子的标记与检测27-28
• 2.2.3 RNA的提取以及定量PCR检测28-29
• 2.2.4 培养上清的收集及Griess反应29
• 2.2.5 CD8+T细胞增殖实验（体外）29-30
• 2.2.6 蛋白质的提取30-31
• 2.2.7 Western Blotting31
• 2.2.8 统计学分析31
• 2.3 实验结果31-37
• 2.3.1 丁酸盐对BMDCs细胞的形态的影响31-32
• 2.3.2 丁酸盐上调BMDCs细胞膜表面共刺激分子和MHC-Ⅱ表达32-33
• 2.3.3 丁酸盐抑制BMDCs细胞IL-6、IL-12和NO的分泌33-34
• 2.3.4 丁酸盐抑制BMDCs激活的抗原特异性CD8~+T细胞的增殖34-36
• 2.3.5 丁酸盐抑制BMDCs细胞MAPK信号通路中ERK分子的磷酸化36-37
• 2.4 讨论37-39
• 第三章 丁酸盐对RA诱导的小鼠骨髓源粘膜树突状细胞分化及功能的影响39-56
• 3.1 实验材料39-40
• 3.1.1 实验动物与试剂39
• 3.1.2 主要溶液的配置39
• 3.1.3 仪器与耗材39-40
• 3.2 实验方法40-43
• 3.2.1 小鼠骨髓细胞的制备及骨髓源粘膜树突状细胞的体外诱导培养40
• 3.2.2 骨髓源粘膜树突状细胞分化效率的检测40
• 3.2.3 细胞表面分子的标记与检测40
• 3.2.4 RNA的提取以及定量PCR检测40-41
• 3.2.5 培养上清的收集及ELISA检测上清中蛋白41
• 3.2.6 ALDEFLUOR染色检测ALDH活性41-42
• 3.2.7 OVA抗原特异性CD4~+T细胞增殖实验（体外）42
• 3.2.8 Foxp3+Treg诱导实验（体外）42
• 3.2.9 统计学分析42-43
• 3.3 实验结果43-53
• 3.3.1 丁酸盐对骨髓源粘膜DCs细胞分化后细胞数的影响43-44
• 3.3.2 丁酸盐上调骨髓源粘膜DCs细胞表面肠道归巢受体和CD103的表达44-45
• 3.3.3 丁酸盐对骨髓源粘膜DCs细胞形态、大小及增殖的影响45-47
• 3.3.4 丁酸盐下调骨髓源粘膜DCs细胞表面CD11c的表达47
• 3.3.5 丁酸盐对骨髓源粘膜DCs细胞表面分子的影响47-48
• 3.3.6 丁酸盐抑制骨髓源粘膜DCs细胞ALDH的活性48-49
• 3.3.7 丁酸盐对骨髓源粘膜DCs细胞分泌细胞因子的影响49-51
• 3.3.8 丁酸盐抑制骨髓源粘膜DCs细胞激活的抗原特异性CD4~+T细胞的增殖51-52
• 3.3.9 丁酸盐对骨髓源粘膜DCs细胞诱导Foxp3~+Tregs功能的影响52-53
• 3.4 讨论53-56
• 第四章 主要结论和展望56-58
• 4.1 主要结论56-57
• 4.2 展望57-58
• 参考文献58-65
• 综述：反式维甲酸（RA）诱导粘膜树突状细胞模型的研究65-73
• 参考文献71-73
• 致谢73-74
• 攻读硕士学位期间发表的文章74

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